SEC-MALS（尺寸排阻色谱与多角光散射联用）测定寡核苷酸分子量

寡核苷酸疗法已在很多疾病适应症的临床治 疗方面取得了快速进展。近几年，已有多种寡核苷酸药物，如短干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）药物获得了FDA上市批准，更有多种microRNA（miRNA）和适体作为治 疗平台正在开发。

治 疗性寡核苷酸是由固相化学合成工艺生产。尽管在寡核苷酸合成及最彻底的后合成清理工艺已经取得了不错的进展，但在链分布方面的异质性仍将存在，这种分布的监控是工艺及质量控制一个基础指标。对该指标的评估，通常是采用毛细管电泳或阴离子交换色谱法。

本篇应用介绍了超高效尺寸排阻色谱法在分辨长度相差一个碱基的不同寡核苷酸样品的能力。

寡核苷酸的SEC分析 

TSKgel UP-SW2000是一款粒径2 μm、12.5 nm孔径的硅基SEC色谱柱，用于分离小蛋白、肽和寡核苷酸。该柱适用于UHPLC系统，也可用于HPLC系统，非常适合从传统HPLC尺寸排阻色谱法到UHPLC系统的方法转移。

图1是采用两根30 cm柱长的TSKgel UP-SW2000色谱柱串联，来分析两种相差一个碱基的寡核苷酸混合物。

图1  N及N-1寡核苷酸的分离

寡核苷酸的SEC-MALS分析 

使用东曹多角度光散射检测仪LenS3™通过SEC-MALS法分析未纯化及纯化后的寡核苷酸样品。

图2 显示了未纯化和纯化后寡核苷酸样品的色谱对照图。图3显示了未纯化的20-mer 的分子量分布情况。分子量示迹线清楚地表明存在较高和较低分子量的杂质。

图2  未纯化及纯化20-mer的UV色谱对照图

图3  未纯化的20-mer的分子量分布（绿色）

利用图4 中的峰分析，可对产物和杂质进行分子量分析。纯化样品的MALS 分析结果（图5）证明了20-mer 寡核苷酸具有极高的纯度。

图4  未纯化的20-mer的峰分析

图5  纯化的20-mer的分子量分布（绿色）

结果与讨论 

TSKgel UP-SW2000是一款尺寸排阻色谱柱，设计用于对分子量为1～150 kDa的生物分子进行的UHPLC分析。其分离范围非常适合分析小蛋白质或多肽及其聚集体。

本应用表明，该色谱柱也可在UHPLC系统上用来分析寡核苷酸。配合使用多角度光散射检测还能获取更多有关寡核苷酸和样品杂质的分子量信息。