- 2025-02-09 05:04:40单细胞分离
- 单细胞分离是指从组织或细胞群中分离出单个细胞的过程。这种技术在细胞生物学、遗传学和生物医学研究中非常重要，可以用于研究细胞功能、细胞信号传导和细胞分化。单细胞分离技术包括机械分离、流式细胞排序和磁珠分离等方法。
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单细胞分离问答
- 2020-12-01 15:57:40讲座通知|单细胞显微操作系统FluidFM BOT在单细胞分离中的应用
- 报告日程报告时间应用讲座：2020年12月2日，上午09:30—10:30上机培训：2020年12月2日，上午10:40—11:40 ；下午13:30 开始报告地点应用讲座：北京大学金光楼311上机培训：北京大学金光楼126报告人&培训人胡西 博士多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT简介 北京大学生命科学学院公共仪器ZX引进的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是国内首套系统。于2020年9月顺利安装于金光楼126室并开始运行，生科院公共仪器ZX覃思颖老师直接负责仪器的管理维护和样本测试工作。 FluidFM BOT是一种将微量注射与原子力显微镜技术相结合的新一代单细胞显微操作系统。它所整合的纳米级位移台能够实现在细胞表面进行JZ的操作和fL级的流体控制。因此FluidFM BOT在技术层面上具有非常ZY的单细胞操纵能力。多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT独特秘籍 在当代生物学与医学的研究中，对单个细胞的分离一直有着很高的需求。然而传统手段中却鲜有能够在原位无损的细胞分离的操作设备和技术。而FluidFM在这一方有着独特的秘籍，它能够在原位仅消化单个细胞并将其转移到指定位置。使用FluidFM BOT进行单细胞分离：通过fL压力泵实现单个细胞的胰酶消化将单个细胞通过强大的微管探针直接抓取并放置在指定部位GX而简便化自动操作多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT应用实例 1. 注射多种gRNAs和Cas9使用FluidFM BOT将荧光标记物共注入CHO细胞，等待细胞表达。2. 候选克隆的单细胞分离将目标细胞直接原位分离到新的培养板的指定位置。3.单克隆的扩增与分析等待单克隆细胞系的增殖，在达到数量后进行测序分析• 多个gRNAs同时注入• 活率:> 95%• 实时成像证明单克隆性• 活率:> 95%• 确保细胞系为单细胞克隆 • ZJ生长位置，避免边缘效应4. 植物原生质体的单细胞分离——数据图片来自北大生科院即使是脆弱而沉重的植物原生质体，FluidFM BOT 也能够“温柔”地将其搬运到指定位置，实现无损分离。5. 对菌群进行单个细菌的分离即使是几个微米的细菌，FluidFM BOT 也能够将它放到指定部分，实现单个细菌的定位操作。
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- 2020-11-12 15:26:35CloneSelect单细胞分离系统用于分选基因编辑的间充质干细胞
- 基因工程细胞的同质性对于很多应用都是必要条件，例如细胞株开发、基因ZL、组织工程以及细胞ZL与再生医学。CRISPR/Cas9基因编辑存在脱靶等情况，无法直接得到均质的细胞，因此需要开展单细胞克隆，之后才能用于临床。CloneSelect单细胞分离系统（CloneSelect Single Cell Printer）采用类似喷墨打印的技术，柔和地产生包裹细胞的液滴无接触地直接分配到微孔板中（图1）。同时，该系统借助智能图像分析，确认细胞数目，分析细胞的形态（大小和圆度）及荧光强度，联动的真空装置将不符合要求的液滴（如空液滴或者含多个细胞的液滴）直接吸走，而符合要求的细胞液滴则分配至微孔板，从而实现对单个细胞的分选和接种。单细胞分离系统是一种可比移液器操作的柔和的单细胞分离技术，而流式分选由于高的液体剪切力和电压的影响，会降低敏感细胞和部分受损细胞（如电转后的细胞）的成克隆率，因此单细胞分离系统更适用于基因工程细胞的克隆，维持细胞活力，并提供直接的单克隆性图像证据。图1：CloneSelect f.sight单细胞分离系统最近发表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9对间充质干细胞（MSC）开展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整个实验流程起始于转染，接着用CloneSelect f.sight单细胞分离系统开展单细胞克隆，随后在DNA、RNA以及蛋白质水平开展分析，ZH开展细胞功能分析（图2）。图2：基因编辑间充质干细胞的单细胞克隆及分析流程。（图片来源：文献1）。作者在CRISPR/Cas9基因敲除质粒中加入了GFP基因，转染间充质干细胞后，用具备荧光分选功能的CloneSelect f.sight系统分选出转染成功的单细胞。系统可设定细胞直径、圆度和荧光强度等指标，分选出单个活细胞并接种至微孔板。图3为系统分选基因编辑的间充质干细胞的5张连续的图像。通过浏览单细胞分离过程中记录的5张连续的图像，作者统计单细胞接种的成功率为93.9±2.7%（n=451），即仅有~6%的孔为多细胞孔，或空孔或无法确认（图4）。这一结果表明f.sight单细胞分离系统可以准确地识别细胞并成功将其接种至微孔内。图3：CloneSelect f.sight系统分选间充质干细胞时采集的5张连续图像，可用于证明单克隆性。（图片来源：文献1）。除了带GFP的基因敲除质粒外，作者还将pmaxGFP质粒转染至间充质干细胞作为对照用于评估单细胞分离效率和克隆率。此外，作者转染了多个不同的基因敲除质粒。虽然不同的质粒因为大小不同而呈现各异的转染效率，但是成克隆率都达到了30%。此外，作者还发现转染质粒的间充质干细胞（31.3±8%）和未转染的间充质干细胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差异较小，这也表明f.sight的单细胞分选过程柔和，因此产生的系统偏差较小（图4）。图4：CloneSelect f.sight单细胞分离系统的高接种效率（左）和高成克隆率（右）。（图片来源：文献1）。接着作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分别从DNA、RNA和蛋白质水平对基因编辑后的间充质单细胞开展分析。ZH作者选出一株双等位基因敲除的间充质干细胞（g23d）检测其成骨分化的能力，并以未编辑的MSC为对照开展平行实验。细胞转移到成骨分化培养基后，分别在第7天、14天和21天用茜素红染色。在第14天，细胞失去细长的成纤维细胞样形态，开始呈现出成骨细胞样的形态，然后在第21天开始出现钙沉积，发展过程与亲本的MSC对照类似（图5）。这表明基因编辑后的MSC其成骨分化能力并没有因为基因编辑和筛选过程而受到影响。图5：RANKL基因敲除的间充质干细胞（g23d）和亲本间充质干细胞的培养和成骨分化。（图片来源：文献1）。在这个研究中，作者搭建了一整套实验流程，起始于CRISPR/Cas9基因编辑，单细胞克隆以及DNA、RNA和蛋白质各个水平的分析和细胞功能测试。实验流程中采用CloneSelect f.sight单细胞分离系统成功GX地分选出基因编辑后带GFP的间充质干细胞。单细胞接种效率高达93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高达31.3% (±8%)。相比传统的有限稀释法和流式分选，CloneSelect单细胞分离系统具有GX率，高活率，操作简单，单克隆性证据充分等优势，是基因工程细胞克隆的理想工具。
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- 2023-03-07 22:09:15高通量单细胞力谱测定！多功能单细胞显微操作技术助力单细胞力学研究
- 单程细胞具有复杂生物学性质，它们通过细胞外基质ECM形成紧密的细胞与基质细胞与细胞连接，诸如上皮细胞通过这种特殊的链接方式构成了屏障层保护人体免受外界损伤。因此细胞之间以及细胞基底的粘附力测定对于研究细胞粘附蛋白的机制有着重要意义。使用力学工具测量细胞间以及细胞与基质之间的粘附力始终不是一件容易的事情。首先，由于细胞与基质的作用力仅为nN级别，因此需要力学精度较高的设备才能够测量，而且在这其中较为适合的工具为原子力显微镜（AFM）。原子力显微镜能够提供纳米级别的操作精度并可测量从pN~nN范围的力谱。但是受制于AFM探针本身的限制，需要借助修饰手段才能够让细胞与探针固定到一起，这个过程十分繁琐，并且由于需要大量手工操作很难实现高通量的测量。而不同的细胞由于细胞异质性使得要想确定粘附力需要较多样本才能获得相对准确的值，无法实现高通量测量直接限制了原子力探针在细胞粘附力上的应用。而多功能单细胞显微操作FluidFM技术的出现改变了这一现状，它使用特殊的中空探针能够轻松地通过负压抓取细胞，取得和AFM近似精度的数据，无需在探针上进行任何修饰，不会改变细胞表面的任何通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。在实验结束后能够通过正压快速丢弃用过的细胞，具备很高的自动化，能够快速测量细胞粘附力。使用FluidFM对细胞操作的基本流程 FluidFM在粘附力测量上具备显著优势。如图所示，FluidFM能够通过负压将细胞吸附到原子力探针的末端，通过高精度位移台的控制将细胞从基底上分离，并且同时记录FD曲线。通过FD曲线能够获得最大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通过高度自动化的控制系统能够在短时间内测量大量细胞粘附力，评估细胞群体分布以及细胞间差异，并且可有效避免传统粘附力测量因准备时间过长而错过最佳测量时间导致的细胞粘附力改变，得到更为精准的结果。近期，Agoston等人使用多功能单细胞显微操作系统FluidFM实现了高通量细胞粘附力测量，对同种细胞不同区以及不同细胞之间的粘附力进行测量和比较。作者首先对Vero和Hela细胞在不同状态下的粘附力进行了测量和比较，总共测量了214个细胞。通过比较明胶涂层上处于单个细胞、孤岛状细胞、致密连接细胞以及单层细胞上游离细胞之间的粘附力，能够明显观测到Vero细胞处于致密连接的细胞粘附力最大，大概在750 nN左右，随着细胞单细胞层的稀疏，细胞粘附力有所下降，而处于细胞层顶部的细胞粘附力最低仅为50 nN左右。这一点充分说明上皮细胞能够在细胞之间形成紧密的连接，而处于细胞层外的细胞则几乎没有粘附力。而对于HeLa这样的肿瘤细胞测量的结果却显示出了截然不同的结果，处于不同状态的细胞有着近似的粘附力，基本都在200 nN左右，这与处于单个游离上皮细胞的粘附力十分接近，表明HeLa细胞在不同环境下仍然具有较高迁徙能力。使用FluidFM对不同区域细胞的FD曲线测定结果和对比 通过对这两种细胞的最大粘附力、最大粘附能量、最大拉伸距离和细胞接触面积进行统计分析可以发现，HeLa肿瘤细胞在粘附力和粘附能量上均有所降低，但是当HeLa细胞形成了单层后，两者区别不大。对比Hela和Vero在不同生长状态下的最大粘附力、最大粘附能量、粘附拉伸距离和粘附面积。再进一步对Vero与HeLa细胞最大粘附力与距离和接触面积进行对比，依然可以得到与单独比较粘附力相同的结果，并且最大能量与细胞接触面积的比值中也存在着类似的结果。由此可见肿瘤细胞通过降低自身粘附力从而获得了更好的迁移能力。对不同状态Vero和A549之间的粘附力/粘附距离、粘附力/粘附面积、粘附能量/粘附面积 总结 细胞粘附力测定在细胞生命科学研究中起着至关重要的作用，然而传统手段中有着各种各样的局限性，主要原因是缺乏一种有效抓取细胞并进行力学测定的手段。现如今FluidFM技术在细胞粘附力测定中的应用，使得研究者们有了一种能够有效、低损的方式抓取细胞，配合原子力显微镜精确测量的特性，真正意义上做到精准、无损、快速的测量单细胞粘附力，帮助研究者寻找细胞粘附力与细胞生命发展、肿瘤细胞转移之间的关系。 【参考文献】[1] A. Sancho, M. B. Taskin, L. Wistlich, P. Stahlhut, K. Wittmann, A. Rossi & J. Groll. Cell Adhesion Assessment Reveals a Higher Force per Contact Area on Fibrous Structures Compared to Flat Surfaces. ACS Biomater. Sci. Eng. 2022, 8, 2, 649–658.[2] P.W. Doll, K. Doll, A. Winkel, R. Thelen, R. Ahrens, M. Stiesch & A.E. Guber. Influence of the Available Surface Area and Cell Elasticity on Bacterial Adhesion Forces on Highly Ordered Silicon Nanopillars. ACS Omega. 2022, 7, 21, 17620–17631.[3] Sankaran, S. Jaatinen, L. Brinkmann, J. Zambelli, T. Vörös, J. Jonkheijm, P. Cell adhesion on dynamic supramolecular surfaces probed by fluid force microscopy-based single-cell force spectroscopy. ACS Nano 2017, 11, 3867–3874.[4] Sancho, A. Vandersmissen, I. Craps, S. Luttun, A. Groll, J. A new strategy to measure intercellular adhesion forces in mature cell-cell contacts. Sci. Rep. 2017, 7, 46152.[5] Ines, Lüchtefeld. Alice, Bartolozzi. Julián M. M. Oana, Dobre. Michele, Basso. Tomaso, Zambelli. Massimo, Vassalli. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. J Nanobiotechnol. 2020, 18, 147.[6] Dehullu, J. Valotteau, C. Herman-Bausier, P. Garcia-Sherman, M. Mittelviefhaus, M. Vorholt, J. A. Lipke, P. N. Dufrene, Y. F. Fluidic force microscopy demonstrates that homophilic adhesion by Candida albicans Als proteins is mediated by amyloid bonds between cells. Nano Lett. 2019, 19, 3846–3853.[7] Mittelviefhaus, M. Müller, D. B. Zambelli, T. Vorholt, J. A. A modular atomic force microscopy approach reveals a large range of hydrophobic adhesion forces among bacterial members of the leaf microbiota. ISME J. 2019, 13, 1878–1882.[8] F. Weigl, C. Blum, A. Sancho & J. Groll. Correlative Analysis of Intra- versus Extracellular Cell Detachment Events vis the Alignment of Optical Imaging and Detachment Force Quantification. Adv. Mater. Technol. 2022, 2200195.【相关产品】 多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM:https://www.yiqi.com/zt2203/product_386418.html
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- 2023-02-24 11:28:18高通量、自动化单细胞力谱测定！多功能单细胞显微操作全新技术助力单细胞力学研究
- 研究现状单程细胞具有复杂生物学性质，它们通过细胞外基质ECM形成紧密的细胞与基质细胞与细胞连接，诸如上皮细胞通过这种特殊的链接方式构成了屏障层保护人体免受外界损伤。因此细胞之间以及细胞基底的粘附力测定对于研究细胞粘附蛋白的机制有着重要意义。使用力学工具测量细胞间以及细胞与基质之间的粘附力始终不是一件容易的事情。首先，由于细胞与基质的作用力仅为nN级别，因此需要力学精度较高的设备才能够测量，而且在这其中较为适合的工具为原子力显微镜（AFM）。原子力显微镜能够提供纳米级别的操作精度并可测量从pN~nN范围的力谱。但是受制于AFM探针本身的限制，需要借助修饰手段才能够让细胞与探针固定到一起，这个过程十分繁琐，并且由于需要大量手工操作很难实现高通量的测量。而不同的细胞由于细胞异质性使得要想确定粘附力需要较多样本才能获得相对准确的值，无法实现高通量测量直接限制了原子力探针在细胞粘附力上的应用。多功能单细胞显微操作FluidFM技术多功能单细胞显微操作FluidFM技术的出现改变了这一现状，它使用特殊的中空探针能够轻松地通过负压抓取细胞，取得和AFM近似精度的数据，无需在探针上进行任何修饰，不会改变细胞表面的任何通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。在实验结束后能够通过正压快速丢弃用过的细胞，具备很高的自动化，能够快速测量细胞粘附力。使用FluidFM对细胞操作的基本流程FluidFM在粘附力测量上具备显著优势。如图所示，FluidFM能够通过负压将细胞吸附到原子力探针的末端，通过高精度位移台的控制将细胞从基底上分离，并且同时记录FD曲线。通过FD曲线能够获得最 大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通过高度自动化的控制系统能够在短时间内测量大量细胞粘附力，评估细胞群体分布以及细胞间差异，并且可有效避免传统粘附力测量因准备时间过长而错过最 佳测量时间导致的细胞粘附力改变，得到更为精 准的结果。
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- 2023-05-20 12:59:12测定单克隆细菌群体中单细胞对抗生素的敏感性
- 鉴于抗菌素耐药性的出现，了解细胞群体对抗生素反应的异质性至关重要。因为药物可以施加选择压力，导致抗性表型的出现。迄今为止，无论是整体方法还是单细胞方法都无法将单细胞易感性的异质性与人群对抗生素的反应联系起来。在这里，我们提出了一个平台，通过使用锚定微流体滴和图像和数据分析管道，测量单个大肠杆菌细胞在不同环丙沙星浓度下形成小菌落的能力。微流控结果与抗生素敏感性的经典微生物学测量结果进行了基准测试，显示池微流控芯片与重复的批量测量结果之间的一致性。此外，单细胞形成菌落的实验可能性用于提供概率抗生素敏感性曲线。除了概率观点外，微流控格式还可以随着时间的推移对大量单个细胞的形态特征进行表征。该管道可用于比较不同菌株对具有不同作用机制的抗生素的反应。
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