国内首例大规模AAV生产案例分享

AAV的大规模的生产案例在国外早已有之，但是在国内的规模主要在50-500L，还没有做到2000L的大规模。今年初，由和元生物主导，协助的国内首例大规模生产（反应器XDR2000，培养规模1000L）顺利下线。可以说，这是国内基因治疗领域的一个里程碑事件，填补了国内的AAV大规模生产的技术空白。

对于大规模的AAV生产，可以说挑战还是非常多的，主要的有反应器工艺参数的放大，转染试剂的选择和用量、三质粒系统比例、MOI、转染混合物混合时间和转导时间等。在这里，我们结合国内外实际的放大生产经验，和大家探讨和分享AAV生产的参数放大，转染混合物配置，以及最后的生产结果等内容；

细胞剪切力的来源主要有两个方面，搅拌桨叶对于细胞的直接作用，搅拌过程中产生的小漩涡对细胞的杀伤。

搅拌桨叶的直接作用，可以用叶尖线速度进行表示，一般来说HEK293细胞的叶尖线速度在2m/s内比较合适。随着细胞水平的提高，现在的叶尖线速度处于2-3m/s，也没有太大影响。

Tip Speed  (m/s)= π*d*n

搅拌桨叶的间接作用，可以用Kolmogorv漩涡长度来表示。搅拌产生的漩涡直径如果和细胞直径接近，就会对细胞产生绞杀作用。因此，可以通过公式或建模的方式，确定某一个转速条件下，Kolmogorv漩涡长度和细胞直径一致的体积大概有多少。例如细胞直径通常为0-20um之间，Kolmogorv漩涡长度位于0-20um对于细胞有杀伤力。

一般HEK293的混合时间位于2min以内，可以保证细胞和营养物质之间达到一个很好的混合效果。可以利用混合时间，确定转速和P/V值的最小值。

总的来说，转速的设计可以适当偏小一些，避免产生剪切力的影响。结合以上几个方面，基本可以锁定放大后的转速值。

HEK293不像CHO细胞那样具有很高的细胞培养密度，对于反应器传质要求和通气量要求都不是太高。而且，HEK293对于微泡通气一般会比较敏感。因此在通气策略上，可以全程用大泡孔径进行通气，或者前期用大泡通气，后期加入少量的微泡进行通气。

空气通气速率这块，可以用表观通气速率和等VVM的方式来找到折中的空气通气速率。HEK293密度一般不会太高，需要的氧气量不大，氧气直接和DO进行关联通气即可。

常见的转染混合物有脂质体，磷酸钙，阳离子聚合物等。转染混合物的选择，以及转染混合物与DNA的比例，都在一定程度上影响着病毒的滴度和空壳率。因此，在小试时，可以结合不同转染试剂的产量以及使用成本进行综合选择。

在大规模生产时，转染混合物的挑战主要在于转染试剂和DNA之间既需要充分混合，混合后需要立即传输到反应器中，避免转染试剂-DNA颗粒物保持时间过长影响DNA的转导效果。部分文献报道，常规转染复合物浓度下，20min后滴度下降到最佳滴度的约90%。