如何使用区带超速离心机对AAV载体进行大规模纯化

2012 年 AAV 基因治疗药物 Glybera 在欧洲获批上市，自此之后，AAV 在基因治疗中一直扮演着非常重要的角色。

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体是一种“小巧玲珑”的病毒载体，由于 AAV 载体具有高安全性，极低免疫原性, 长期表达稳定及强特异性等独特优势, 在目前基于病毒载体的基因治疗数百项临床项目中， AAV 载体独领风骚，占据了半壁江山^【1】。

尽管 AAV 优势突出，使其被广泛应用。但生产制备工艺复杂度高，尤其是纯化工艺规模化放大等方面的挑战是制约其商业化的重要瓶颈。想要大规模生产，首先需要突破大规模纯化工艺。

研究显示 AAV 空壳颗粒会显著降低 AAV 载体的整体转导率，并且 AAV 空壳颗粒将会加重炎症免疫反应的强度。尽管 AAV 载体在低剂量给药时，免疫反应不强烈，但数据显示，AAV 载体在高剂量给药时可能引起较为强烈的炎症免疫反应。因此，AAV 载体纯化过程中，有效去除空壳颗粒显得尤为重要。

目前，AAV 载体大规模纯化常用的方法为层析法。常规离子交换层析和亲和层析等层析法在纯化 AAV 载体过程中不能有效的将全基因组 AAV 载体与空壳 AAV 载体有效分开。

采用密度梯度超速离心法(密度梯度液-氯化铯（CsCl）或碘克沙醇（iodixanol）)能够比层析法更为有效地将 AAV 载体完整颗粒与空壳颗粒区分开来，这种方法是利用高速旋转产生的强大离心力，使样本中的 AAV 颗粒与杂质成分按照密度差异进行分层。完整的 AAV 颗粒、空壳颗粒与其他杂质会因其各自特有的浮力密度集中在分离介质中不同的特定区域，从而达到纯化 AAV 载体的目的。此外，超速离心法纯化 AAV 载体还不受 AAV 血清型限制。

然而，AAV载体长时间接触氯化铯（通常需要2天）会导致AAV载体的活性降低^【2】及碘克沙醇中碘对于碘过敏人群不友好，一定程度上限制了 AAV 在临床上的应用。

该方法所用的区带离心转子为 P35ZT 或 P32ZT（Eppendorf 公司 Himac产品），该转子拥有 1.69 L 处理通量，腔室被十字隔板划分为四个扇形区室，每个扇形区室可作为一个大型离心空间使用。此腔室设计显著增加了 AAV 载体料液的上样体积，有效解决了密度梯度超速离心法受限于小规模纯化的难题。

使用该方法将 AAV 载体样本上样后， 以 30,000~35,000 ?rpm 的转速离心 4~5 小时，AAV 载体即可达到理想的分离效果。使用区带超速离心分离纯化所需的时长远低于通常的 2 天，从而降低了离心过程中的 AAV 载体因与氯化铯长时间接触所致的部分病毒失活。

A 图为空壳载体，B 图为全基因组载体

为突破病毒载体纯化的大规模局限性，Eppendorf 公司还提供 Himac CC40NX 超速连续流离心系统，一次性批次处理离心通量可高达数升、连续流离心模式处理通量高达 200 L，可以有效地分离病毒颗粒及纳米级别颗粒。在原本工艺的基础之上，缩短离心时长，有效去除空壳颗粒的同时，保留载体活性，突破技术瓶颈。

参考资料：

1. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1001263/full

2. Hinderer C, Katz N, Buza EL, Dyer C, Goode T, Bell P, et al. Severe toxicity in nonhuman primates and piglets following high-dose intravenous administration of an adeno-associated virus vector expressing human SMN. Hum Gene Ther. 2018;29:285–98.

3. Wada M, Uchida N, Posadas-Herrera G, Hayashita-Kinoh H, Tsunekawa Y, Hirai Y, Okada T. Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor. Gene Ther. 2023 Aug;30(7-8):641-648.