在上期的膜过滤应用系列中，我们介绍了澄清过滤中的深层过滤在疫苗中的应用，对于澄清后的料液，经过捕获层析、中间纯化及精纯后经过纳滤膜过滤以进行病毒去除，在本期内容中，我们将着重介绍除病毒技术在CHO重组蛋白疫苗中的应用技术。
除病毒技术介绍
生物制品的起始原材料通常来源于微生物发酵或者人/动物源的细胞、组织和体液等，其生产或制备过程有存在病毒污染的潜在风险。内源性病毒污染源可能来自工程细胞、组织或体液，外源性病毒污染源可能是由物料、人员、环境引入的。
国内外就保证药品安全性的基本原则是一致的，主要可归纳为如下三条：
1
对细胞系和其他原料（包括各种培养基）进行选择和检测，确保其不含可能对人有感染和致病作用的病毒。
2
对生产工艺中清除感染性病毒的能力进行评估。
3
在生产的适当步骤对产品进行病毒检测，确保产品未受感染性病毒的污染。
不同类别生物制品因其来源、潜在污染病毒的特性、生产工艺、给药方式、适用人群等方面有所差异，对应的病毒安全性控制要点也不同。疫苗制品的病毒安全性控制主要包括对原材料和辅料的来源控制，产品病毒污染检测和筛选。采用重组技术生产的疫苗应符合重组治疗性生物制品的相关要求，重点考虑工程细胞、工程菌的来源控制，及生产工艺过程的病毒清除能力。
除病毒滤器的选择及应用
生物制品生产过程中多个工艺步骤具有病毒灭活/去除的能力。如巴氏消毒法、干热法、低pH孵育法、有机溶剂/表面活性剂 (S/D) 法、色谱法以及膜过滤法等。
以上这些方法有着不同特点，在实际生产工艺的选择时需要根据潜在病毒特性、结合产品特性及生产工艺特点、病毒清除机制进行综合考量。
除病毒过滤的机理是通过尺寸排阻的方式，将病毒颗粒截留在滤膜表面或者滤材深部，达到病毒清除的效果。过滤过程主要考察滤器的载量、滤速和病毒拦截能力。诸如蛋白浓度、聚体水平、杂质水平、料液冻融情况以及操作等都是影响除病毒过滤结果的关键因素。同时可采用不同的预过滤的方式来优化实验结果。
除病毒滤器的膜材主要有聚醚砜 (PES) 和聚偏二氟乙烯 (PVDF) 两种。思拓凡的Pegasus Prime除病毒过滤膜为20 nmPES材质，滤速较快，通常大于300 LMH。采用双层不对称结构，表面特殊设计的凹槽结构可以有效增加滤膜表面积，提高滤膜的抗污堵能力。尤其适合处理中、低污堵料液。
图1：Pegasus Prime滤器表面结构
对于中高浓度或者粘度大的复杂料液，可采用20 nm改性PVDF材质的PegasusSV4除病毒过滤器。该产品对样品浓度及性质耐受度高，通常在加毒后滤速衰减不明显。采用专利的新月形打褶方式，每10英寸滤芯膜面积可达2.25 m2，减少工艺使用滤芯的数量，同时Z小化系统滞留体积，提高生产效率，降低工艺成本。可获得更高的载量和更优的COGS。
除病毒过滤器往往需要配合预过滤使用，增加预过滤器可以大大提高除病毒过滤膜的处理能力。通常可选择除菌过滤器或者深层过滤器。以Prime除病毒滤器与Protect预过滤为例，结果（如图2）Pegasus Protect预过滤器大大提升了除病毒滤器的处理量。
图2：预过滤器对病毒过滤的影响
图3，图4分别展示了不同浓度的CHO细胞表达的重组蛋白料液Prime和SV4除病毒滤器上的表现，由图可见Prime在低浓度的重组蛋白疫苗上滤速快，过滤过程中滤速持续衰减，SV4在中高浓度的重组蛋白疫苗上虽然滤速比Prime慢，但是滤速平稳，在难过滤料液上也有独特的应用。
图3：Protect+Prime除病毒的过滤载量vs滤速曲线
料液为CHO细胞表达的重组蛋白疫苗，浓度<1mg/ml
图4：DJL+SV4除病毒的过滤载量vs滤速曲线
料液为CHO细胞表达的重组蛋白疫苗，浓度<5mg/ml
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