肉类颜色测量指南之肉色研究方法A-F

肉类颜色测量指南

肉色研究方法A-F

如何使用本节

本节详细介绍了研究肌红蛋白的常用方法。在多数情况下，研究人员可直接选用现有方法。若需根据特殊条件调整方法，则应审阅相关研究文献以确保方法的适用性。

与所有定量分析化学一样，研究人员必须 对最终计算予以严格注意，特别是使用适当的消光系数，确定校正稀释因子，并验证方程式中的所有单位都消除了所需的测量单位。

协议索引

A. Prerigor Meat的pH

B. Postrigor肉或熟食的pH

C. 新鲜或煮熟肉类的总肌红蛋白（以DMb计）

D. 新鲜或熟肉的总肌红蛋白（等比点测定法）

E. 熟肉中亚硝基血红素和总血红素含量

F. 小样本的亚硝基血红素和总血红素含量

G. 分离肌红蛋白用于体外研究

H. 从牛骨骼肌中分离线粒体

I. 完整肌肉或碎肉的耗氧量

J. 完整或研磨肉的肌红蛋白还原能力

K. 骨骼肌提取物对肌红蛋白的还原作用

L. 检测变性血红蛋白血色素的反射率

M. 腌肉的亚硝酸盐分析

N. 腌肉及配料硝酸盐分析

O. TBARS 用于氧化性酸败的快速湿法检测

P. TBARS 氧化性酸败的检测方法——蒸馏法

A . Prerigor Meat的pH

原则：

在预冷肌肉中，pH会缓慢下降，因为糖酵解产生的乳酸会积累。为了确定死后特定时间的pH 值，会添加碘乙酸来抑制糖酵解（特别是甘油醛-3 - 磷酸脱氢酶）， 防止进一步产生 乳酸。

试剂：

1. 150 mM Potassium chloride=11.184 g/L

钾溶液中配制 。 如需将溶液pH调至7 . 0，可用 几滴0.1 N盐酸或0.1 N氢氧化钠调节。

溶液应保持新鲜（3°C下保存不超过3天）。分析前，溶液需自然升温至室温。使用前请检查pH值。分析过程中，溶液需在搅拌板上持续搅拌，以确保获得准确的pH值。

由于预冷混合样品容易堵塞电极， pH计应每4至5个样品后用两种标准缓冲液验证其 准确性 ， 并在必要时重新校准 。

操作步骤：

1. 使用前用4.0和7.0缓冲液对pH计进行标准化。

2. 称取10 g样本肌肉组织放入搅拌杯中。

3. 向烧杯中加入100 mL的5 mM NaIAc和150 mM Potassium chloride。

4. 混合样品30秒，或直至充分混合但未乳化。

5. 测量pH。

记下

确保电极清洁且响应速度合理。要获得准确的肉类pH测量值，需要正确护理和清洁电极、代表性样本采集以及样本制备。

参考Bendall，J. R. 1973 .肌肉的死后变化。见《肌肉的结构和功能》第2卷，G. H. Bourne编，Acad. Press，New York，NY，第243-309页。

B. Postrigor肉或熟食产品的pH

操作步骤：

1. 使用前，用4.0和7.0缓冲液对pH计进行标准化。

2. 称取10 g细碎样品放入搅拌杯中。

3. 添加100 mL去离子水或蒸馏水。

4. 混合样品30秒，或直至充分混合但未乳化。

5. 测量pH。

参考

Koniecko，E. S. 1979 .肉类化学家手册。第53、54和62页。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。

c. 新鲜或熟肉中肌红蛋白总量（以DMb计）

原则

样品粉碎

1. 将样本切成小方块（或采用方案D中的样本制备方法）。

2. 将立方体浸入液氮中，直至液氮快速沸腾完成。

3. 向Waring搅拌器中加入少量液氮。

4. 将搅拌机开启2至4秒，使其冷却。搅拌机应保持干燥，以免转子结冰。

5. 将粉碎后的样品倾倒在洁净的纸张上，随后用该纸张将样品倒入Whirl-Pak袋中，尽可能去除空气。

6. 将样品存放在超低温冷冻箱（-60 °C）中直至使用。

肌红蛋白测定方法

1. 将两份(2)10克的粉碎样品称重至Waring搅拌机碗中，并记录每份样品的精确重量。

2. 加入90 mL冷磷酸钾缓冲液（0.04 M，pH 6.8）。稀释因子为：90 mL + 10 g = 100/10 = 10 ×

稀释。

3. 将样品混合1分钟。

4. 将均匀混合的样品部分转移至50毫升离心管中，随后置于0至4 °C 颜料浸提1小时。注意，虽然混合样品有100mL，但离心后仅需少量（3 mL）上清液（下面的步骤6）。

5. 在4°C下以15,000 × g 离心 样品30分钟 。

6. 将上清液收集于小烧杯中，取3 mL上清液通过0.4微米孔径的注射器滤膜过滤，转移至1 cm宽的分光光度计比色皿中进行澄清。

7. 向贮备液中加入亚硫酸氢钠（见下文注释），将样品中的所有肌红蛋白转化为DMb形式 。

8. 使用扫描分光光度计对样品进行700至400 nm波长范围的扫描，DMb的吸收峰应位于433 nm和556 nm波长的±2 nm范围内。

记下

样品中的所有肌红蛋白必须为DMb形式。433 nm处的Soret峰是DMb的良好指示剂。仅当扫描后出现的峰在433 nm的2 nm范围内时，才分析样品。如果峰在433 nm的2 nm范围内，则读取433 nm处的峰吸光度。 使用以下公式计算总肌红蛋白浓度 。

计算

1 M DMb溶液在433 nm波长下，于1厘米光程比色皿中的摩尔吸光系数（消光系数）为114,000/ M（Antonini和Brunori，1971）。

牛肌红蛋白的分子量为16.949 kDa，家禽肌红蛋白为17.3 kDa（Joseph等人，2010a）。因此，肌红蛋白的分子量可取为平均值17 kDa。

记下

在肌红蛋白氧化还原研究中，二硫代硫酸钠用于将MMb还原为DMb，随后再转化为OMb。通 常使用1：10的二硫代硫酸钠与肌红蛋白比例。然而，有时可能需要更高用量。直接向肌红蛋 白溶液中添加二硫代硫酸钠粉末有时会导致蛋白质变性。为减少这种情况，可使用10%的二 硫代硫酸钠储备溶液来还原MMb。对于每1 mL浓度为2.5 mg/mL的肌红蛋白溶液，可添加并 混合5微升10%的二硫代硫酸钠。如有必要，可再添加5微升直至形成DMb。这将增强二硫代 硫酸钠在肌红蛋白溶液中的混合效果，且不会导致肌红蛋白显著稀释。二硫代硫酸钠储备溶 液必须储存在棕色瓶中，4°C保存，并需每2至3天新鲜配制 。

对于因色素含量低或经烹煮变性的样本中肌红蛋白浓度较低的情况，可通过添加少量K₃[Fe(CN)₆]将提取的色素转化为高铁肌红蛋白。需注意控制添加量，过量的氧化剂会使肌红蛋白溶液呈现黄色，从而干扰吸光度测定。高铁肌红蛋白在409纳米处具有非常强的索雷特峰（Bowen，1949），这使得检测低浓度色素成为可能。在肌红蛋白吸光度光谱中，索雷特峰

通常具有峰值吸光度。

因此， 稀释因子的选择需根据每个峰的具体特性、测试样本中提取色素的含量 以及 光谱仪的峰值吸光度限制来确定。

在低氧MAP中，煮熟的牛排使用了0.11 L/10 g肉的稀释因子。对于含有更多Mb的生样品，离心后取1 mL 上清液， 再用2 mL冷的0.04 M磷酸缓冲液（pH 6.8）在比色皿中进行稀释（稀释因子3 ： 1）。

将10克用高氧MAP（甲基丙烯酸酯）包埋的熟牛排样本，用50毫升磷酸盐缓冲液稀释，稀释倍数为0.06 L/10克肉（Hunt等，1999）。

参考文献

安东尼尼，E.，和M.布鲁诺里。 1971 。血红蛋白和肌红蛋白与配体反应。荷兰阿姆斯特丹北荷兰。

Bowen，W. J. 1949. 肌红蛋白的吸收光谱和消光系数 . J. Biol. Chem. 179 ： 235 –245. Hunt，M. C.，O. Sørheim ，and E. Slinde. 1999. 肉末中肌红蛋白形式的颜色和热变性。 J. 食品科学64： 847 -851。

Joseph，P.，S. P. Suman，S. Li，C. M. Beach，and J. R. Claus. 2010a.火鸡肌红蛋白的质谱表征和热稳定性。LWT -Food Sci. Technol. 43 ： 273 – 278 。

沃里斯，P.D. 1979 。鲜肉中血红素色素的提取。食品技术杂志14： 75 -80。

D. 新鲜或熟肉中的总肌红蛋白（等比点法测定）

原则

该程序（Faustman和Phillips，2001）与协议C非常相似。将所有形式的肌红蛋白（DMb、OMb和MMb）提取至pH 6.8的0.04 M磷酸盐缓冲液中（Warriss，1979）。然而，与将色素转

化为特定氧化还原形式不同，总Mb浓度通过525 nm处的吸光度测定，这是肌红蛋白三种形式

的等峰点。需要注意的是，残留的血液血红蛋白也会被提取，并对总肉色素含量有所贡献。

试剂

流程

1. 将肉绞成1/8英寸厚的薄片，或绞成3毫米的方块，或使用 协议C中的液氮法 。

2. 称量5克重复肉样，放入50毫升聚丙烯管中。

3. 每5克样品加入25毫升冰镇磷酸盐缓冲液（pH 6.8,0.04 M）（Warriss，1979；Tro

ut，1989）。稀释因子为25毫升+5克=30毫升/5=6。

4. 使用聚丙烯管或类似探针式匀浆器的小直径头，以低速将样本匀浆40至45秒。

5. 将样本置于冰上（0至4℃）保存1小时。

通过加热变性的Mb百分比 = [1−（加热后Mb浓度÷加热前Mb浓度）]×100（Trout，1989）。

参考文献

Bowen ，W . J . 1949 .肌红蛋白的吸收光谱和消光系数。 J . Biol . Chem .179：235– 245 .

Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鲜肉变色的测量. 《食品分析化学新协议》 第F3.3单元，S.J. Schwartz主编，John Wiley and Sons Inc.，纽约。

Joseph，P.，S. P. Suman，S. Li，C. M. Beach，and J. R. Claus. 2010a.火鸡肌红蛋白的质谱表征和热稳定性。

LWT -Food Sci. Technol. 43 ： 273 – 278 。

Trout，G. R. 1989. 肉红蛋白变性及煮熟牛肉 、 猪肉 、 和火鸡肉颜色的变化受 pH、氯化钠、三聚磷酸钠和烹饪温度的影响。J. Food Sci. 54： 536 。

沃里斯，P.D. 1979 。鲜肉中血红素色素的提取。食品技术杂志14： 75 -80。

e. 熟肉中亚硝基血红素与总血红素含量

原则

精加工肉类色素的提取采用含80%丙酮和20%水的溶液（含样品水分）进行（霍恩西，1956）。

色素含量（以血红素原硝基化物ppm计） 根据样品在540纳米处的吸光度计算得出。 烟熏效率以 血红素原硝基化物占总血红素的百分比表示。研究表明，优质烟熏肉类中硝基血红素占比通常超过80%（皮尔逊与陶伯，1984）。 另一种测定总血红素的方法是使用酸化丙酮溶液，该溶液可提取所有血红素蛋白 中的血红素原（现统称为血红素原）。此时提取物中的血红素原会转化为血红素（即血红素原），其浓度可通过样品在640纳米处的吸光度计

算得出。

记下

本试验中提取的亚硝基血红素色素 非常容易褪色 ，因此需要格外小心，使用还原照明和用箔纸覆盖的容器来尽量减少光化学氧化。

亚硝基血红素（熟肉色素）含量测定方法：

1. 称重前，先切除脂肪组织，然后将瘦肉切成细末。完成所有步骤光线减弱后的后续步骤。

2. 取10克瘦肉末放入高脚100毫升烧杯中（以减少蒸发）。

将瘦肉碎与43mL含有40mL丙酮和3mL水的溶液充分混合。考虑到典型的10g肉样含有7mL水， 提取溶液是80% 丙酮 ， 从而在不提取 DMB 、 OMb 或MMb 的情况下 （Hornsey ， 1956）定量提取大量的亚硝胺色素 。

3. 在弱光条件下，继续对样品进行5分钟的间歇性混合。

4. 5分钟后，用中速滤纸（Whatman #1或同等产品）过滤溶液，转移至250 mL锥形瓶

中。

5. 使用分光光度计测定滤液在特定波长下的吸光度（光密度）

使用1厘米比色皿，波长540纳米。空白对照使用80%丙酮/20%水溶液。

计算NO-血红素色素浓度

吸光度与辐射波长、吸收物质的性质及分子量密切相关。特定波长下的毫摩尔吸光度（符号E ）通过实验测定获得，即在1厘米比色皿中测定1 mM浓度溶液的吸光度。 80% 丙酮水溶液中 ，氧化态血红素（NO-heme）在540 nm波长处的毫摩尔吸光度为11. 3（Hornsey ， 1956）。 血红素分子量为652道尔顿 。

表达血红素浓度时所需的换算系数（1ppm = 1 µg / g）以及稀释系数也需考虑 。 稀释系数 等于总萃取液体积（毫升）除以样品重量（克）。 总萃取液体积包含样品的水分含量 和乙醇水溶液的体积 。 大多数新鲜和 熟食肉类的水分含量约为70%。因此，对于一 个含7毫升水的10克样品，总萃取体积=7毫升水+43毫升乙醇溶液，稀释系数= 50/10=5.0。若样品水分含量与70%存在显著差异，应调整乙醇溶液的配比，使 萃取过程中乙醇水溶液的水分含量达到80%（Cornforth，2001）。

霍恩西将换算系数四舍五入为290。

总色素含量测定法

1. 将10克碎肉样本（含70%水分）与40毫升丙酮、2毫升 水 和1毫升浓盐酸 的溶液混合。这样就得到一个80：20的丙酮 ： 水 比例溶液， 用于提取血红素色素。对于水分含量低于70%的样本，需添加足量水分，使提取混合物达到80：20的丙酮与水比例。

2. 在过滤前，将溶液在室温下储存并定期搅拌一小时。酸化萃取液可使新鲜和熟成肉色素中的血红素基团转化为酸性血红素。 酸化丙酮溶液可从未熟成和熟成肉色素中萃取酸性血红素形式的血红素基团（DMb 、 OMb 、 MMb 、NO - Mb）（Hornsey ， 1956）。

3. 测定滤液在640 nm处的光密度（1 cm比色皿），以确定总血红素色素含量。使用步骤1中的溶液（酸化80%丙酮溶液）作为空白对照。

4. 在总色素的估算中，可对512和处的吸收峰进行吸光度测定。

640 nm。如果在酸化的80% 丙酮中 NO-血红素氧化为酸性血红素 是完成的 ，则比值应小于1.9。 计算521 / 640 nm处的吸光度 ， 以验证比值 < 9 。

5. 要以ppm表示总色素浓度，需将光密度值乘以640 nm by 680。

计算总色素浓度和固化效率

固化效率：将总颜料转化为亚硝基颜料的百分比， 也可表示固化后颜色褪色的程度 。

参考文献

霍恩西，H. C. 1956. 熟制风干猪肉的颜色。上半部分：一氧化氮-血红素色素的估算。《食品与农业科学杂志》。23:534–540.

Pearson，A. M.和F. W. Tauber. 1984.分析方法.第360-361页，加工肉类.第二版.A. M. Pear son和F . W . Tauber ，编 .

AVI Publishing ，Westport ，CT .

小样本的亚硝基血红素和总血红素含量

原则

Pearson和Tauber（1985）改进了Hornsey 的（1956）分析小样本（2 - g）样品的程序，

减少了所需的试剂量，并增加了每天分析的样品数量。将样品置于带盖试管中，以防止蒸发。

试剂

1. 丙酮-a（丙酮水溶液）：将90 mL蒸馏水置于1 L容量瓶中，加入 分光光度级丙酮 ， 搅拌并定容 。

2. 丙酮-b（酸性丙酮）：缓慢将20 mL浓盐酸加入80 mL水中。 将稀释的盐酸溶液转移至1 L容量瓶中 ， 搅拌 ， 并用额外的分光光度级丙酮定容 。

流程

1. 在弱光下进行所有操作，以减少色素褪色。

2. 取2.0克绞碎瘦肉样本，置于50毫升聚丙烯离心管中称重。

3. 向50毫升试管中加入9.0毫升丙酮，使丙酮浓度达到80%。

4. 用探针式均质机或玻璃棒充分混合。

5. 盖紧试管以尽量减少丙酮的蒸发，并轻轻旋转混合。

6. 在黑暗中静置10分钟，然后用中速滤纸过滤到 玻璃试管 中。

7. 将 滤液转移至1 - cm石英比色皿中，并在540nm处读取吸光度（避免使用 一次性塑料比色皿，因为暴露于丙酮后会变得不透明）。按照之前所述方法计算亚硝基色素浓度。

8. 另取2.0 g样品，用丙酮乙醇溶液处理。

9. 静置1小时，然后过滤。

10. 按之前的方法对提取物进行过滤，并在640 nm处读取吸光度。 按之前描述的方法 计算总色素

和固化效率。

参考文献

Cornforth，D. P. 2001. 熟肉与腌制肉色素的分光光度法及反射率测定。收录于《食品分析化学现行实验指南》F3.2单元，由S. J. Schwartz主编，John Wiley and Sons Inc.出版社，纽约。

霍恩西，H.C. 1956. 熟制腌猪肉的颜色。I. 一氧化氮-血红素色素的估计。J. Sci. Food Agric. 23 ： 534 –540。

皮尔逊，A. M.，和F. W. 塔伯。1984。分析方法。收录于《加工肉类》第二版，第360–361页。由A. M. 皮尔

逊和F. W. 塔伯编， AVI 出版社，康涅狄格州韦斯特波特。