肉类颜色测量指南之肉色研究方法K

K.骨骼肌提取物对肌红蛋白的还原作用

原则

肌红蛋白还原酶活性通过监测MMb还原为DMb的过程来测定，随后在有氧体系中快速生成OMb。

酶活性的计算依据是反应初始线性阶段（1至2分钟）期间OMb在580 nm波长处吸光度的增加。

操作步骤

1. 取5克（称重至0.1克）不含可见脂肪或结缔组织的肌肉组织样本，将其切成小块。

2. 将样品在20 mL的0.2 mM磷酸钠缓冲液（pH 5.6）中均质化（或肌肉的pH值)持续90秒，或持续作用，直至肌肉组织结构消失。

3. 在 4°C 下使用Beckman超速离心机以35,000× g 离心30分钟。

4. 将上清液倒入小烧杯中，用0.4微米注射器滤器过滤2-3 mL，转移至小试管中。

5. 配制试验溶液：

5 mM EDTA二钠

50 mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.65（将此pH调整至所需pH）

3.0 mM Potassium Ferricyanide

0.75 mM甲基肌红蛋白（马骨骼肌来源，货号Sigma M-0630，或经纯化处理的猪/牛来源，

详见纯化方案）溶于30 mM磷酸钠缓冲液

1.0 mM NADH（Sigma N-8129）

6. 打开日立UV-2010分光光度计并预热10分钟。

7. 如果可能，加载一个分光光度法软件程序，该程序可在180至240秒内测量580nm处的吸光度增加；否则手动加载软件.

8. 将空比色皿放入分光光度计比色皿中，并将仪器归零。

9. 向塑料微孔板中加入以下试剂量：

100 µL 5 mM EDTA

100 µL 50 mM柠檬酸盐缓冲液

100 µL 3.0 mM Potassium Ferricyanide

200 0.75 mM甲基肌红蛋白的 µL 值

200 µL 去离子水

10. 将每个微量比色皿放入分光光度计比色皿中，同时加入

100 1 mM NADH的 µL 值

200 µL 过滤后的肌肉提取物

11. 用移液管充分混匀，然后至少释放两次溶液。

注意：加入试剂并尽快混合，因为反应会立即开始。

12. 尽快开始在580nm处测量吸光度增加，并持续进行180至240秒。随着肌红蛋白被肌肉提取物还原，吸光度在580nm会增加。

14. 肌红蛋白还原酶活性的表达方式为：在时间进程的初始线性阶段（通常为前段或前两分钟），每分钟每克肌肉中还原的肌红蛋白纳摩尔数。

样例

如果0秒时580nm处的吸光度为0,60秒时吸光度为0.132，则ΔAbs580nm=0.132/分钟。使用比尔定律计算甲基肌红蛋白到氧合肌红蛋白的浓度变化。

A = Ebc，其中

A=吸光度（或吸光度变化）

b=路径长度（塑料微孔板为1 cm）

E=消光系数（12000）C = 浓度mol/L） / 升 0.132=12000×1×c

c = 0.132/12000

c = 11.0 × e-6 M/分钟/5克肌肉或11 µM /分钟/5克肌肉

记下

记住，这里说的是浓度变化，而不是浓度本身。将浓度变化乘以比色皿中的体积，即可将浓度换算为摩尔。

11 e-6 mol/L/分钟/5克 × 0.0015升 =

16.5×10^-9摩尔/分钟/5克肌肉=

16.5 nmol每分钟/5克肌肉=

3.3 nmol/分钟/克肌肉

每分钟每克肌红蛋白的还原量为3.3 nmol，即为报告数值

记下

如果将吸光度的变化取120秒（2分钟）的平均值，然后将最终数值除以2 。

参考文献

Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌红蛋白还原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514.

Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影响牛肉肌肉的颜色、高铁肌红蛋白还原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。

Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通过近红外血氧测定法检测三种

后强直期骨骼肌中肌红蛋白的氧化还原形态。Food Chem. 123 ：456—464。

L.检测变性血红蛋白血色素的反射率

原则

变性珠蛋白血红素色素的存在可通过528和558纳米处的反射峰来判断（Ghorpade和Cornforth，1993）。

材料和设备

1. 白色标准品（硫酸钡粉末）

2. 配备样品和标准品接口的记录型分光光度计及积分球附件。

3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。

操作步骤

1. 使用白色标准品（粉状硫酸钡）在样品和标准端口的反射附件中，将记录分光光度计的反射率从420至700nm标准化为100%。

2. 获得3 cm × 3 cm的均匀肉片（覆盖反射附件上的样品端口，确保无任何暴露区域），厚度>3 mm。

3. 为排除空气和减少褪色，将新鲜切片迅速放入透明聚乙烯真空袋（厚度1.5mil）中。从底部向上压紧袋子以消除气泡。测量反射率时，样品仍留在透明聚乙烯袋中。

4. 将装袋样品紧密放入反射率球的样品口，使新鲜切片的表面朝内（即朝向检测器）。记录420至700纳米波长范围内的表面反射率（以标准值百分比表示）。变性珠蛋白血红素色素的存在可通过528和558纳米附近出现反射率峰值来判断（戈尔帕德和康福斯，1986；康福斯，2001）。

5. 可选：若需获取新鲜样本与褪色样本的差异光谱，可将 对照组肉片置于空气中褪色15至30分钟 。

6. 将样品装入袋中，按新鲜样品的描述记录反射光谱。

7. 从新鲜样本光谱中减去基线光谱（褪色切片）。

参考文献

Cornforth，D. P. 2001. 熟肉与腌制肉色素的分光光度法及反射率测定。收录于《食品分析化学新实验指南》F3.2单元，由S. J. Schwartz主编，John Wiley and Sons Inc.出版社，纽约。

Ghorpade，V.M.和D.P.Cornforth.1993.在65°C或82°C下烹制的猪肉烤制过程中产生粉红色的色素的光谱。J.Food Sci. 58：51-52,59。

M. nitrite熟肉分析

原则

亚硝酸盐离子被溶入热水中。取部分提取液与格里斯试剂（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成峰值吸光度为540 nm的粉红色偶氮染料。粉红色调的深浅与初始亚硝酸盐浓度（按比尔定律）成正比。样品亚硝酸盐浓度通过亚硝酸盐标准曲线计算，并考虑样品稀释倍数。

试剂和仪器

1. NED试剂：将0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要时过滤，储存在棕色玻璃瓶中。

2. 磺胺试剂：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（体积分数）乙酸中，必要时过滤，置于棕色玻璃瓶中保存。

3. 亚硝酸盐标准：

a. 贮备液：亚硝酸钠1000ppm。取亚硝酸钠1.0g溶于水，稀释至1L。

b. 中间溶液：100 ppm亚硝酸钠。取100 mL原液，加水稀释至1 L。

c. 工作溶液：1 ppm亚硝酸钠。取10 mL中间体溶液，用水稀释至1 L。

4. 取3-4张滤纸，分析盒中滤纸的亚硝酸盐污染情况。通过每张滤纸过滤约40mL水。加入4mL磺胺类试剂， 搅拌，静置5分钟，加入4毫升NED试剂，混合后静置15分钟。若检测到阳性结果，请丢弃整盒。

操作步骤

1. 称取5克细碎组织，将样本充分混匀后置于50毫升烧杯中。

2. 加入约40mL80℃水，用玻璃棒充分混匀，破碎所有块状物， 并转移至500 - mL容量瓶中。

3. 用热水分次清洗烧杯和棒，将所有洗液倒入烧瓶中。

4. 加入足量热水，使体积达到约300mL，将烧瓶转移至80°C 水浴中， 并静置2小时 ，偶尔摇动 。

5. 冷却至室温，用水稀释至体积，并再次混合。

6. 过滤，向 50 - 50 mL容量瓶 中含5至50 µ g亚硝酸钠的等分试样中加入2.5 mL磺胺类试剂， 并混合 。

7. 5分钟后，加入2.5 mL NED试剂，混合，稀释至体积，再次混合， 15分钟内显色 。

8. 将溶液转移至分光光度计比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺类试剂和2.5mLNED试剂的空白溶液为对照，测定540nm处的吸光度。

9. 制备标准曲线：向50毫升容量瓶中分别加入10、20、30和40毫升工作硝酸钠溶液，加入2.5毫升磺胺类试剂，混匀后按上述步骤进行，从步骤7开始。最终溶液中硝酸钠浓度为1 ppm时，标准曲线呈直线。

计算

样品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g样品）=标准曲线给出的ppm NaNO2×50/分装量（mL）×500/样品重量(g)

参考

AOAC.1990.《熟肉中亚硝酸盐的测定方法973.31》，载于《标准分析方法》第15版，K.Helrich主编，弗吉尼亚州阿灵顿：AOAC出版社，第938页。

n. 烤肉及配料的硝酸盐分析

原则

亚硝酸盐和硝酸盐离子需用热水提取。初始亚硝酸盐浓度通过与格里斯试剂反应后产生的粉红色（540nm波长）强度测定，具体方法如先前所述。测定硝酸盐+亚硝酸盐时，将样品提取液与钒（III）溶液+格里斯试剂混合孵育。酸性溶液中的钒可将所有硝酸盐离子还原为亚硝酸盐。随着亚硝酸盐生成，其会与预先存在的亚硝酸盐一同被格里斯试剂捕获。硝酸盐

浓度=总亚硝酸盐（钒测定法中硝酸盐+亚硝酸盐的总和）-初始亚硝酸盐。该方法经过改良，将钒+格里斯试剂合并为单一溶液，并改用分光光度计比色皿进行检测。

程序（NEMI ，2011）

1. 将约200 mL 0.5 M盐酸倒入一个小瓶中。

2. 将瓶子置于带通风罩的天平上，直接称取约0.5 g三氯化钒（III）放入瓶中（为避免其粘附在铲子、称量器等上）。如果 仍有未溶解的颗粒残留 ， 通过 > 2微米注射器过滤器 进行过滤。

3. 加入约0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）C₂H₁₀Cl₂N₂ 或 (CH₂NH₂·HCl)₂（NED）并溶解。

记下

将打开的VCl瓶 3 放置在无水硫酸钙等干燥剂上。VCl在潮湿空气中会 3 释放腐蚀性气体，但在试剂中溶解后 将不再释放气体。 氯化钒不被归类为有毒或对环境有害（MSDS 数据），与旧方法中使用的镉不同。

VCl 3 + Greiss试剂溶液冷藏可保存约一周，但对空气和光线敏感，若在室温下放置数日且未加盖，易被氧化。

将以下体积的样品和试剂直接混合在半微量比色皿中，或按所用仪器的细胞大小进行比例调整。

对于1至20ppm（µg /mL）硝酸盐氮，将20 µ L样品与1000 µL 试剂混合。

对于1至10ppm硝酸盐氮，使用45 µL 样品和1000 µL 试剂。

当硝酸盐氮含量低于1ppm时，使用500µL样品和500µL试剂（注：1,000µL=1mL）。（如果新批次样品的浓度未经标定，可通过筛选几个代表性样品快速估计其浓度范围。将等量样品与试剂混合。对几个标准品也做同样的处理 。在烘箱或热水下对样品进行短暂加热 。基于颜色比较，判断出有效的浓度范围。）

将样品移入半微量比色皿，随后向所有比色皿中加入试剂。盖上盖子，轻轻倒置以充分混合。样品需在室温（20-25℃）条件下保存。显色反应在4-5小时后逐渐减弱，6-10小时后达到峰值。比色测定需以试剂空白（水）为对照，在540nm波长下进行。建议将标准品与样品共同分析，以便建立校准曲线用于浓度计算。虽然4-5小时后即可进行测量，但为确保准确性，建议次日制备样品并测定吸光度。颜色可能可在60 ℃下约2小时内显色，或将样品混合于小试管中，在约100℃下加热10至15分钟，确保颜色充分显色。

肉类样品的制备采用与亚硝酸盐测定相同的热水萃取法。计算硝酸盐/亚硝酸盐浓度时，需考虑样品的稀释倍数。

该方法经过轻微调整，具体说明可参见 NEMI （NEMI ，2011）。

参考文献

多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用单一试剂测定硝酸盐的分光光度法。分析。Lett .36：2713—2722。

NEMI（国家环境方法索引）。2011。国家环境方法索引。2011。 h**ps:// ***.nemi.gov/ 。

o. t BARS氧化酸败检测法——快速湿法

原则

在Thiobarbituric Acid（TBA）存在下，丙二醛和脂质氧化的其他醛类产物（TBA反应物质；TBARS）会形成粉色显色剂，其主吸收峰位于532至535 nm。然而，在干扰性糖类存在时，会形成黄色显色剂，采用Tarladgis（1960）蒸馏法可避免此现象。

试剂

1. TBA贮备液：0.375%Thiobarbituric Acid、15%Trichloroacetic acid和0.25N盐酸 。

2. 100mL贮备液足以进行20次单独检测。 贮备液可在室温下避光保存（封装于铝箔包装容器中）。

操作步骤

1. 将目标产物切碎或绞碎，称取两份0.5克样品。

2. 向每个样品中加入2.5 mL TBA贮备液，使稀释倍数为6。混匀。

3. 将样品置于沸水中加热10分钟，使用松盖试管（圆底Pyrex 或聚丙烯离心管）。 注意： 密封盖试管在加热过程中可能爆裂。加热过程中阳性样品会变成粉色。

4. 用自来水冷却试管。

5. 在4 °C 下以5000× g 离心10分钟，获得澄清上清液。

6. 小心地将上清液的一部分移至分光光度计比色皿中，注意溶液保持澄清。

7. 在532 nm处测定上清液吸光度，空白对照为含有所有试剂，但不含肉的溶液。

8. 使用粉色TBA显色剂的消光系数 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu，1958），计算以ppm丙二醛表示的TBA值具体方法如下 ：

TBARS 数值（mg MDA/kg） = 样品 A 532 ×（1M TBA显色剂 / 156 ，000）× [（1mol /L/M]×（0.003L/0.5g 肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，或TBARS 值（ppm）= 样品A A 532 ×2.77 。

参考文献

Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒体脂质过氧化.方法酶学.52： 302 — 304 .

Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 鱼类制品酸败度的Thiobarbituric Acid法测定 .II.丙二醛的定量测定.食品技术.12：9—12.

P.t BARS氧化酸败检测法——蒸馏法

原则

该方法中，将样品置于水中加热，通过蒸汽蒸馏收集挥发性丙二醛及其他TBA反应物质（TBARS）。向 蒸馏液等分试样中加入TBA溶液，形成粉红色TBA显色剂 ， 通过分光光度法进行定量（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。

解决方案

1. TBA试剂：将1.44g2-Thiobarbituric Acid（分子量144.1）溶于450mL冰醋酸中。用50-mL容量瓶定容。搅拌后，置于暗处（用铝箔包装）保存。

2. 磺胺试剂：将1克磺胺溶解于含有40毫升浓盐酸和160毫升蒸馏水的溶液中。

操作步骤

1. 将10克绞碎或切碎的肉样与50毫升蒸馏水混合，使用Waring搅拌器。定量转移至圆底加热瓶（凯氏瓶），并添加47.5毫升额外水。加入2.5毫升6 N盐酸溶液（1,2浓缩盐酸与水混合）。

2. 为防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加热时起泡，可加入消泡剂（如陶氏H-10消泡剂或同类产品）。

3. 将烧瓶充分加热以产生蒸汽 。 使用水 冷凝蒸馏装置 ，将50mL蒸馏液收集到量筒中。每份样品所需时间约为10分钟。

4. 将蒸馏液充分混匀，用移液管吸取5mL注入50mL带塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 试剂 。

5. 与 由5mL蒸馏水和5mLTBA试剂组成的空白 混合后，将其与空白一起浸入沸水浴中，精确浸泡35分钟。

6. 将冷却后的样品瓶置于自来水下静置10分钟。使用零点校准的分光光度计，在538nm处测定吸光度，以TBA-水空白为对照。

参考文献

Koniecko，E. S. 1979. 《肉类化学家手册》，第53、54和62页。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。

塞弗特 ，M .，M . C . 亨特 ，J . P . 格罗贝尔 ，S . M . 瑞安 ，D . E . Johnson ，和 R . A . 莫德伦 . 2006 . 乳酸钾和新鲜猪肉香肠配方对有光和无光展示货架寿命的影响。J. Food Sci. 71：C390 – C394.

塔拉德吉斯、B. G.、B. M. 沃茨和M. T. 尤纳森，1960年。《用于定量测定变质食品中丙二醛的蒸馏法》，载于《美国油脂化学学会杂志》第37卷第44–48页。