肉类颜色测量指南之肉色研究方法G-J

G.分离肌红蛋白用于体外研究

原则：

纯化肌红蛋白有时是必要的，例如用于比较 不同物种肌红蛋白（Mb）的自氧化速率。肌红蛋白（分子量约16,949）可以从骨骼肌或心肌中轻松纯化 。

其红色便于在层析过程中直观观察。该方法使用相对廉价的设备即可获得较高产率的肌红蛋白（Faustman和Phillips，2001；改编自Wittenberg和Wittenberg，1981年以及Trout和Gutzke，1996年的早期方法）。

样品、试剂和溶液

1. 去脂去筋的牛肉块

2. 均质化缓冲液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C

3. 氢氧化钠

4. 硫酸铵

5. 透析缓冲液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C

6. 色谱洗脱缓冲液（5 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.5）在4 °C

记下

为了抑制/减少亚铁肌红蛋白的形成，均质化和所有后续步骤应在0至5 ° C和高pH（8.0至8.5）下进行。

设备

搅拌器、纱布、4℃ 下 20,000×g 转速离心机、透析管（分子量截留值12，000至14，000）、Sephracryl S-200HR色谱柱（30×2.5至cm）、蠕动泵。需要额外试剂和设备来测定蛋白质浓度，或 基于其消光系数计算肌红蛋白浓度 。

制备匀浆

1. 将150克切碎的肌肉与450毫升匀浆缓冲液放入搅拌机中进行匀浆处理高速运转1至2分钟。

2. 将匀浆液均等分装至各试管中， 在4℃ 下以3000× g 离心10分钟。

3. 弃去池上清液， 用氢氧化钠 调节所得上清液的pH至8.0。

4. 用两层纱布过滤上清液，以去除脂质和结缔组织颗粒。

沉淀肌红蛋白

1. 将滤液饱和至70%硫酸铵浓度（472克硫酸铵/升滤液），用氢氧化钠调节pH至8.0，搅拌1小时。

2. 将匀浆液均等分装至各试管中，4℃条件下以18,000× g 离心20分钟，去除沉淀蛋白。

3. 合并上清液，弃去沉淀。

4. 将上清液从70%浓度调整至100%硫酸铵饱和度（通过添加上清液中额外添加228克硫酸铵/L），用氢氧化钠调节pH至8.0， 并搅拌1小时 。

5. 将匀浆液均分至各试管中，随后以1000×g离心1小时。20,000 × g ，4 ° C。弃去上清液，加入1或2 mL冰冷却缓冲液以帮助沉淀物的回收。

透析和纯化肌红蛋白

1. 将沉淀的肌红蛋白转移至透析管中，并在4 ° C下使用透析缓冲液（1体积蛋白质，10体积缓冲液）透析24小时，每8小时更换缓冲液。

2. 使用蠕动泵 ，用色谱洗脱 缓冲液（3个色谱柱体积）平衡Sephacryl S-200 HR色谱柱。

3. 将透析液加入色谱柱，以60mL/小时的流速用色谱洗脱缓冲液洗脱肌红蛋白提取物。该步骤将血红蛋白与肌红蛋白分离。血红蛋白将首先洗脱为淡红色/棕色条带。肌红蛋白随后作为 明显可见的深红色条带洗脱。

4. 使用分馏收集器收集含肌红蛋白的馏分。

肌红蛋白浓缩物

1. 将所有含肌红蛋白的组分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳法可评估肌红蛋白提取物的纯度，该提取物应产生一条分子量为17kDa的单一蛋白条带 。

2. 使用离心浓缩器浓缩肌红蛋白溶液。

3. 或者（步骤2的替代方案），将肌红蛋白溶液饱和至100%硫酸铵浓度（761克硫酸铵/升溶液），将pH调节至8.0，搅拌溶液1小时。

将溶液均分至各试管中，并在4°C下以20,000×g离心1小时000×gg。排弃上清液，并按前述方法透析肌红蛋白 。

4. 或者（步骤2和3），肌红蛋白可通过 Trout和Gutzke（1996）所述 的超滤法浓缩。

5. 测定肌红蛋白溶液的蛋白质浓度，并分装至 -80℃ 冷冻保存。

记下

这种肌红蛋白分离程序的产量相对较低，需要2到3个月的收集才能得到大量的肌红蛋白。

参考文献

Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鲜肉变色的测量. 《食品分析化学现行标准进行》 第F3.3单元，S.J. Schwartz主编，John Wiley and Sons Inc.，纽约。

特劳特，G.R.和D.A.古兹克。1996年。一种简单、快速的制备方法，用于分离和纯化氧肌红蛋白。肉类科学43 ：1- 13 。

Wittenberg，J. B.和B. A. Wittenberg. 1981.肌红蛋白的制备. Methods Enzymol. 76 ：29–42.

H.从牛骨骼肌中分离线粒体

原则

线粒体分离包含三个步骤：细胞裂解、匀浆和离心。使用蛋白酶处理骨骼肌可显著促进线粒体释放，同时提高产量。

试剂

1. 1 M蔗糖：将342.3 g蔗糖溶于1 L蒸馏水中，混匀，分装成20 mL等分试样， 于-20℃ 保存。

2. 0.1M Tris/MOPS：将12.1克Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]溶解于500mL蒸馏水中，调节pH 至7 。使用MOPS[3-（N-吗啉代）丙磺酸]粉末，将溶液定容至1L，并于4°C保存。

3. 1 M Tris/盐酸：将121.14 g Tris溶于500 mL蒸馏水中， 用盐酸将pH调节至7.4 ， 将溶液稀释至1 L并室温保存 。

4. 1 M EDTA：将372.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）溶于500 mL 蒸馏水中，并于4℃保存 。

5. 10% BSA：将10 g BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL蒸馏水中， 存放于-20℃ 。

7. 10mMEDTA：将2.92gEDTA溶于1L蒸馏水中，并于4℃ 保存 。

8. 0.5%BSA：将5 g BSA溶于1 L蒸馏水中，并于-20 °C 下保存。

9. 纳加酶：配制20毫克/100毫升分离液浓度的纳加酶溶液（即20毫克/100毫升）。重要提示：其他蛋白酶（胰蛋白酶）的选择取决于研究者偏好和方案，以及用于分离线粒体的肌肉类型。

关键步骤3： 实验当天制备所有缓冲液，以避免储存的缓冲液中细菌/酵母生长。

关键步骤4： 由于pH值取决于温度，所有溶液的pH值都应在25°C时测量。

操作步骤

1. 取5克（精确至0.1克）目标肌肉组织样本，确保不含可见脂肪或结缔组织，随后切成小块。

2. 取小烧杯，将肌肉组织浸入20毫升冰浴PBS（磷酸盐缓冲液）中，其中添加了10 mM EDTA。

3. 用剪刀把肌肉切成小块。

4. 用含10 mM EDTA的冰冻PBS缓冲液对碎肌肉进行2-3次清洗。

5. 将切碎的肌肉重新悬浮于5毫升冰冻的含10 mM EDTA的PBS溶液中。

6. 以200 × g 离心5分钟，弃去上清液。

重要提示： 组织与分离缓冲液的优化比例范围1：5 至1：10（w/v）。

8. 使用以1600rpm转速运行的Teflon杵的Potter-Elvehjem研磨器均质化肌肉组织；将均质化的肌肉捣碎10至20次 。

重要提示： 在开始实验前5分钟将玻璃器皿置于冰浴中预冷。匀浆及后续步骤必须在4 ℃下进行，以尽量减少磷脂酶和蛋白酶的激活，从而避免对肌肉造成损伤。

9. 将匀浆液转移至50 mL聚丙烯Falcon管中， 在4℃下以700× g 离心 10分钟 。

10. 将上清液转移至玻璃离心管中， 4℃ 以8000× g 离心10分钟。

14. 使用Biuret/Bradford法中的一种方法测定线粒体浓度Bicinchoninic Acid assay（BCA）法。

参考文献

Bhattacharya，S. K.，J. H. Thakar，P. L. Johnson和D. R. Shanklin. 1991.使用含有EDTA和Nagarse的离子介质从仓鼠中分离骨骼肌线粒体。分析生物化学192： 344 — 349 。

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i. 完整肌肉或绞肉的耗氧量

原则

新鲜切割的肉片需经过标准化的氧气处理（即让其充分氧化），随后进行真空包装。通过酶呼吸作用导致的氧化肌肉组织（OMb）减少量，可作为衡量组织氧气消耗能力的指标。在25℃水浴或培养箱中，立即记录400-700纳米波长范围内的反射光谱，并在20分钟后再次测量。

氧化肌红蛋白水平通过K/S转换公式计算得出，具体方法详见第九节。K/S610/K/S525比值越高，表明OMb含量越高。氧气消耗量（OC）以基于起始值与最终值的百分比变化形式呈现。

设备和用品

1. 真空包装机

2. 聚氯乙烯薄膜

4. 能扫描并记录400至700 nm表面反射率的分光光度计（见 第IX节）

操作步骤

1. 例如，所有待测样品必须处于相同温度（4 ° C）下，否则温度越高，样本的耗氧量越快，而藻华发育（即富氧）则越慢；温度越低，耗氧量越慢，藻华发育则越快。

2. 为确保氧气供应均匀，所有样本需保存在 2-4℃ 的环境中。对于完整肌肉样本，应用锋利刀具切取3厘米×3厘米×2厘米的样本块，尽量去除可见脂肪和结缔组织。

研磨样本则需准备体积相当的均匀压实立方体，其可见脂肪含量应与样本瘦肉部分的典型水平相当。切记使用钝刀具，以免破坏表面结构。同时避免对研磨样本的表面进行过度操作或挤压（参见Madhavi和Carpenter，1993年研究）。

3. 如果表面不是新鲜的切割面，那么在开始开花步骤之前， 只需去除一层薄薄的表面层，以暴露新鲜的组织 。

4. 用一小块透气膜覆盖新切面，防止干燥。将聚氯乙烯膜（常用）平铺一层，确保表面均匀接触空气。记录膜的透气性。

5. 在2至4°C（或其他标准时间）下进行2小时的显色。注意使所有样品在该步骤中保持相同的温度，因为显色非常依赖于温度。

6. 花开后，去除聚氯乙烯薄膜并将样品放入氧气渗透性极低的袋中。用高真空快速真空包装；保持样品间的真空均匀。

7. 立即扫描样品表面，以测定400至700nm范围内的反射率，从而确定初始OMb 。 光谱仪必须通过真空袋薄膜进行校准。

8. 为加快氧气消耗，使用25 ° C的培养箱或水浴。20分钟后（或根据所用肉类的适当标准时间）重新扫描同一表面。

计算

%OMb=[K/S610÷K/S525（100%DMb）]-[K/S610÷K/S525（样品）]÷[K/S610÷ K/S525（100% DMb）]-[K/S610÷ K/S525（100%OMb）][×100]。

氧消耗量=[（初始OMb%−最终OMb%）÷初始OMb%]×100。

记下

马达维和卡彭特（1993年）提出了一种利用反射光谱仪测量氧气消耗量（OC）的检测方法。该方法通过配备反射光谱附件的分光光度计，首先对真空包装样品的表面有机物（OMb）含量进行测定，并以5分钟为间隔（总计20分钟）在4℃条件下重复测量。

样品尺寸经过调整（2.5×2.5×0.5厘米）以适应反射光谱仪的样品接口。有机物的相对浓度采用克日维茨基（1979年）的方法计算，但唐等人（2004年）对其进行了改进，并推荐了 修订后的波长参数（详见第九节）。氧气消耗量以百分比形式表示 ，即真空包装样品在10分钟内消耗的初始表面有机物量 。

Mancini、Hunt和Kropf（2003）报告了一种使用610nm反射率直接测定OMb的方法。这是可能的，因为OMb在610nm处具有其独特的反射率，而610nm 对DMb和MMb都是等渗的（关于肉表面反射率测量和 K/S 比率 的进一步讨论，参见第IX节）。该方法已成功使用（参见King等人，2011）。

部分研究采用单位时间内有机物（OMb）百分比变化值来报告实际“耗氧量”，但这种方法操作繁琐且耗时。对于大量样本，通常将“耗氧量”计算为样本初始有机物含量的“平均百分比降幅”。 样本脱氧时间需标准化 ， 通常 20分钟即可检测出样本差异 。

参考文献

King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.测量时间对肌红蛋白还原活性和耗氧量与长肌肉色稳定性仪器测量值之间关系的影响。Meat Sci. 87 ：26— 32 。

Madhavi，D.L.和C.E.Carpenter.1993.衰老和加工影响牛肉肌肉的颜色、高铁肌红蛋白还原酶和耗氧量。J.Food Sci.58：939—942。

曼奇尼，R.A.，M.C.亨特，和D.H.克罗普.2003.610纳米反射率估计牛肉表面的氧合血红蛋白含量.Meat Sci.64：157—162.

Mohan，A.，M.C.Hunt，T.J.Barstow，T.A.Houser和DM.Hueber. 2010a. 通过近红外血氧测定法检测三种后强直期骨骼肌中肌红蛋白的氧化还原形态。Food Chem.123：456—464。

唐，J.，C.福斯特曼，和T. A.霍格兰。2004年。重新审视克日维茨基，水性肉类提取物中肌红蛋白氧化还原形式分光光度测定的方程式。食品科学杂志69： C717 — C720 。

J.完整肉或碎肉的肌红蛋白还原能力

原则

首先将样本切片浸入稀硝酸钠溶液中浸泡20分钟，使表面色素氧化生成甲基甲基蓝（MMb） 。随后将切片（厚度1.27厘米）真空包装，在30℃环境下通过测量 K/S比值（572/525纳米波长）持续监测表面MMb含量2小时。样品的还原能力定义为培养期间表面MMb浓度的百分比降幅。MMb浓度的下降程度可视为组织还原铁血红素铁 能力的反映。

试剂

1. 0.3%（w/w）亚硝酸钠溶液：称取大烧杯，称取3.0g NaNO2加入烧杯中，加蒸馏水至1000克，每日新鲜配制，室温孵育。

操作步骤

1. 取一块3cm×3cm×2cm的肌肉组织样本（无可见脂肪或结缔组织），若使用绞肉则取一块大小相近且紧密压实的样本，以防止样本浸入时碎裂。

2. 务必先对样本进行定位，以便确定后续要评估的表面。该表面可能是新切面，也可能是展示过的表面。

3. 2 将样品浸入0.3% NaNO 在0.3% NaNO 溶液中室温浸泡20分钟以诱导MMb形成。研磨后的样品可置于小筛网上，以帮助降低和提升立方体，同时尽量减少碎裂。

4. 从烧杯中取出样品，用布擦去多余的溶液。 尽可能保留三维形状，并将用于评价的表面放入 不透水的袋中并真空包装（真空度均匀）。真空可能会稍微压平或圆化样品 。

5. 立即扫描400至700 nm的反射率，以确定 表面形成的MMb的初始量 。 保持表面完整性 。

6. 将样品置于30°C的培养箱中 ，2小时后重新扫描以测定MMb的剩余量。

计算

%MMb=[K/S572÷K/S525（100%DMb）]-[K/S572÷ K/S525（样品）]÷[K/S572÷K/S525（100%DMb）]-[K/S572÷K/S525（100%MMb）][×100]。

MRA（MMb减少的百分比）=[（初始%MMb−最终%MMb）÷初始%MMb]×100 或将初始MMb作为MRA的指标（见下文注释）。

记下

部分研究者（McKenna等，2005；Mancini等，2008）指出，亚硝酸钠溶液中氧化反应生成的MMb初始量可作为样本 MRA 的良好指标。但King等（2011）发现，MMb的还原百分比比其初始生成量更具参考价值。因此，建议同时采集并统计分析MMb的初始生成量及其在孵育过程中的还原百分比。

参考文献

King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.测量时间对肌红蛋白还原活性和耗氧量

与长肌肉色稳定性仪器测量值之间关系的影响。Meat Sci. 87 ：26— 32 。

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