Nature！IF 50.5！清华大学张二荃团队首次揭示了RUVBL2调控真核生物钟的分子调节机制！

昼夜节律广泛存在于地球上的生物体中，在生物体响应环境的昼夜变化、维持生理稳态和健康中发挥着重要作用。昼夜节律紊乱可能会引发睡眠障碍、免疫力下降等疾病，威胁到人类健康。

在20世纪90年代，研究发现并提出，在昼夜节律的分子机制中，生物钟（circadian clock）扮演着极其关键的角色。生物钟是生物体内调控生理和行为节律（约24小时周期）的核心机制，它通过转录-翻译负反馈环路（transcription–translation feedback loop，TTFL）的形式实现计时功能，此分子机制在真核生物中高度保守。

（1）转录因子与DNA启动子区域的顺式元件结合，激活靶基因（包括自身抑制因子）的表达；

（2）抑制蛋白在胞质中积累并转位至细胞核；

（3）核内抑制蛋白与转录因子相互作用，抑制其自身转录，形成约24小时的周期性振荡。

这种TTFL模型，在多种真核生物钟系统中具有普遍适用性。但随着研究的深入，发现该TTFL模型面临诸多挑战：①虽然该TTFL模型机制在真菌、植物和动物等不同物种中表现出相似的结构特征（结构保守），但分子组成成分缺乏同源性（独立进化），暗示可能来源于不同的起源。②转录和翻译过程需要消耗细胞约75%的能量，TTFL模型如何克服能量代谢障碍来维持高度有序的昼夜节律振荡，目前还没有解释清楚。因此，研究试图寻找并解释真核生物钟的分子机制，并探究真核生物与原核生物钟的潜在共同特征。

文章首次揭示了P-loop NTP酶家族成员（AAA+（ATPases Associated with diverse cellular Activities））RUVBL2（又名RuvB-like 2）是真核生物中保守的时钟成分，是真核生物钟的共同核心成分，阐述了RUVBL2通过能量依赖的NTP酶活性调控生物钟的分子机制，并证实了其在真核生物昼夜节律系统中具有进化保守的核心调控功能。与蓝藻生物钟核心蛋白KaiC类似，RUVBL2表现出独特而稳定的低活性ATP酶特性，其催化效率（约13个ATP分子/天），较常规ATP酶（103-10?个ATP分子/天）显著降低。这一发现也支持了最初在蓝藻中发现的“缓慢ATP酶活性是生物钟共同特征”的这一观点。

图2.循环振荡系统的起源模型。该示意图显示了所研究的每个生物体的起源，起源于最后一个普遍共同祖先（LUCA）。周期长度受KaiC或RUVBL ATP酶活性的调节（论文链接：doi.org/10.1038/s41586-025-08797-3）

提出全新假设：在远古生命起源阶段，随着原始生物钟的出现，低活性的 P-loop ATP 酶成为生物钟系统的核心组件。在蓝藻中，KaiC 结合 KaiA 和 KaiB 组成了一个连接到 TTFL 的强大振荡器，而在真核生物中，含有 P 环的 AAA+ ATP 酶 RUVBL2 及其同源蛋白通过与 TTFL 生物钟蛋白相互作用，参与生物钟调控。KaiC 和 RUVBL2 极低的 ATP 酶活性共同决定了生物钟的 24 小时节律振荡，这一机制或许是生物钟系统进化的共同特征。研究团队并对这一假设进行一系列的实验设计和论证。

• 免疫共沉淀（Co-IP）与蛋白质组学分析显示，RUVBL2与生物钟核心复合物（如CLOCK/BMAL1、PER/CRY）存在物理相互作用。

• 染色质免疫沉淀（ChIP）分析RUVBL2对CLOCK/BMAL1靶基因（如Per、Cry）启动子结合的调控，RUVBL2通过维持时钟蛋白复合物的动态组装（如促进PER/CRY降解或CLOCK/BMAL1的激活），直接调控TTFL的周期性振荡。

• RUVBL2的NTP酶活性可能作为细胞内能量状态的传感器，将代谢信号（如ATP/ADP比率）与生物钟调控偶联，解释生物钟如何响应营养或能量胁迫。

研究团队通过系统性遗传筛选，获得了RUVBL2的三种功能突变体：节律紊乱型、周期缩短型、周期延长型。将这些突变体通过腺相关病毒载体递送至小鼠视交叉上核（SCN）后，可显著改变其自主运动活动的昼夜节律模式。

生化分析证实这些表型变异均与ATP酶活性改变直接相关。酶动力学分析表明，野生型RUVBL2的ATP水解活性极低，每日仅催化约13个ATP分子水解，其周转率较典型ATP酶显著降低。

RUVBL2 作为保守的低活性 ATP 酶，在调控真核生物钟周期方面发挥了关键作用，在人类、果蝇和真菌等不同真核生物钟系统中均得到验证：①RUVBL2直系同源物与各物种核心时钟蛋白存在保守的物理相互作用；②跨物种的RUVBL2突变均导致一致的节律表型。

使用抗癌药物 CB-6644 抑制 RUVBL2 活性，可剂量依赖性延长昼夜周期，为新型生物钟调节剂的开发提供新的方向。

综上所述，该研究不仅确立了RUVBL2在真核生物昼夜节律系统中的核心地位，证实了 RUVBL2 作为核心生物钟组分的作用，也首次揭示了慢速ATP酶活性这一最初在蓝藻时钟中发现的特征性机制，如何以类似 KaiC 的机制调节真核生物的昼夜节律，首次证实了其在真核生物中同样具有进化保守性，为理解生物钟的分子进化提供了新视角。

这一发现丰富了真核生物钟的分子调节机制，深化了对生物钟能量耦合机制的理解，也为靶向昼夜节律紊乱的干预策略提供了新思路，在进化生物学和生物钟研究领域具有重要意义。

将野生型或突变的同源基因组克隆至携带潮霉素B抗性（# 60225ES，Yeasen Biotechnology）的PBS质粒中，该质粒携带潮霉素B基因，用于后续筛选。