微电极追踪“代谢刺客”：氢气的争夺如何决定肠道入侵的成败？

肠道微生物群涉及复杂的代谢相互作用，包括分解和再利用宿主和饮食来源的营养物质。对这些资源的竞争可以限制病原体的生长。然而，一些肠道病原菌可以通过目前尚不清楚的机制侵入这一生态位。利用沙门氏菌腹泻的小鼠模型和转座子突变体筛选，我们发现鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium,S.Tm）在未受干扰的肠道中的初始生长是由S.Tm的hyb氢化酶(hyb hydrogenase)驱动的，该酶促进消耗氢气（H?）——这是微生物群代谢的一个核心中间产物。在竞争性感染实验中，与野生型S.Tm相比，hyb突变体在感染早期表现出生长缺陷（约降低100倍；p<0.05）。但在抗生素介导的宿主微生物群破坏后，这些差异消失。此外，将耗氢菌引入微生物群会干扰依赖hyb的S.Tm生长。因此，H?是微生物群代谢的一个阿喀琉斯之踵(Achilles'heel)，可被病原体利用，并可能为预防感染提供机会。

哺乳动物的肠道内密集定殖着微生物，统称为微生物群。微生物群具有一个代谢活动网络，促进将复杂的饮食和宿主来源的碳水化合物高效分解为短链脂肪酸（SCFAs）、氢气（H?）和二氧化碳。微生物发酵产物随后被交叉喂养的次级发酵菌消耗、被宿主吸收或释放到环境中。肠道生态系统入侵(Gut ecosystem invasion)在本文中定义为病原体（或任何其他新来者）在宿主肠道中的初始生长阶段。在此阶段，肠道黏膜看起来健康，微生物群（仍然）完整，并限制了营养可用性。这阻止了大多数新到达细菌的生长。尽管营养可用性稀缺，肠道病原体仍能入侵肠道生态系统。然而，使肠道病原体能够“入侵肠道生态系统”的机制在很大程度上仍不清楚。

人类食源性病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium,S.Tm）是腹泻的病原体，可以在这种营养耗竭的环境中生长到高数量并引发疾病。动物实验证实，肠道管腔内的病原体密度必须达到每克粪便10?-10?菌落形成单位（cfu）才会引发肠病。由于低至103-10?细菌的接种量足以在人类中引起腹泻疾病，我们推测S.Tm可以在面对完整的微生物群和健康的肠道时进行初始生长。S.Tm在这个密集定殖的生态位中生长的机制仍然是个谜。这种机制可以使用“低复杂度微生物群”（low complex microbiota,LCM）小鼠进行研究，这种小鼠允许S.Tm在肠道管腔内生长。LCM小鼠是前无菌小鼠，最初被接种了“改变的沙德勒菌群”的菌株，并允许小至200个菌落形成单位（cfu）的接种量在肠道管腔内定殖。在感染后的头2天内，没有肠病的迹象，病原体生长到每克粪便10?-10?cfu（肠道生态系统入侵）。当病原体达到每克粪便10?-101?cfu的最终密度时，在感染后第3-4天引发黏膜炎症。因此，LCM小鼠为分析宿主肠道定殖的所有阶段（包括肠道生态系统入侵）提供了一个独特的模型。

Unisense氢气微电极系统的应用

Unisense微电极被用于测量小鼠盲肠腔内的氢气（H?）浓度，使用了Unisense氢气微电极（H?-50），其尖端直径为50微米。处死小鼠后，取盲肠及回肠、大肠，固定于含2%琼脂的培养皿底层，并覆盖45°C的2%琼脂顶层以固定组织。使用26号针头在组织上打孔，以便微电极尖端能够穿透盲肠腔在每个盲肠中，使用氢气微电极分别在盲肠尖端、中段和与小肠、大肠连接处测量了三个不同位置的氢气浓度。氢气微电极测量不同小鼠模型（包括无菌小鼠、低复杂微生物群小鼠和传统小鼠）盲肠中的氢气浓度，发现只有存在微生物群的小鼠盲肠中存在高水平的氢气，而无菌小鼠的盲肠中未检测到氢气。

实验结论

鼠伤寒沙门氏菌（S.Tm）在肠道生态系统入侵的初始阶段依赖于其hyb氢化酶来利用氢气（H?）。氢气是肠道微生物群代谢的产物，S.Tm通过消耗氢气获得能量，从而在肠道微生物群的密集定殖环境中获得生长优势。实验表明，S.Tm的hyb氢化酶仅在感染的前24小时内（即肠道生态系统入侵的初始阶段）是必需的。在这个阶段，S.Tm利用氢气作为能量来源，能够在未受干扰的肠道微生物群中生长。而在感染后期，当肠道炎症被触发后，氢气的利用不再对S.Tm的生长起关键作用。通过引入消耗氢气的细菌，可以干扰依赖hyb的S.Tm生长，这表明氢气是微生物群代谢的一个潜在弱点，可能被病原体利用，也可能为预防感染提供机会。通过对不同宿主的微生物群基因组分析，发现几乎所有可用的肠道微生物群基因组都显示出氢气生成途径的证据，表明氢气的利用可能是肠道病原体入侵的一个普遍策略。

图1.hyb-氢化酶突变体在肠道生态系统入侵中表现出缺陷。(A)将hyb-氢化酶突变体与氢化酶正常的同源菌株S.TmWT按1:1比例混合（5×10?cfu，经灌胃），并感染五只天真的LCM小鼠。通过平板计数测定粪便中两种菌株的负荷，并计算竞争指数（C.I.）。(B)Lipocalin-2 ELISA监测实验期间的炎症发生。箱线图表示第一四分位数和第三四分位数，须表示最小值和最大值。

图2、S.Tm仅在非炎症早期阶段从H2中获益。(A)在五只LCM小鼠中进行竞争指数实验，检测S.Tmavir hyd3在体内的适应性。ns表示不显著（p≥0.05），**表示p<0.01，Mann-Whitney U检验。(B)第4天p.i.盲肠组织病理评分，对组织进行HE染色并评估炎症情况。(C)第1天和第4天分别通过平板计数测定S.Tmavir hyd3和S.Tmavir的粪便载量。*p<0.05，配对数据进行单侧Wilcoxon符号秩检验（虚线表示配对关系）。

图3、S.Tm氢化酶突变体在肠道入侵缺陷与微生物产生的H2有关。(A)测定盲肠腔中H?浓度，在三个不同位置进行测量，并修正H?S的电极交叉敏感性（每组3只小鼠）。(B)在五只无菌小鼠中进行S.Tmavir hyd3与S.Tmavir的C.I.实验（5×10?cfu，灌胃，第1天p.i.分析）。(C)在天真的LCM小鼠或链霉素预处理小鼠中进行S.Tmhyd3与S.TmWT的C.I.实验（每组10/5只小鼠，第1天p.i.分析）。(D)在天真的CON小鼠或链霉素处理小鼠中进行相同实验（每组5只小鼠）。(E)第1天p.i.的盲肠组织病理评分。(F)第1天p.i.对竞争菌株的负荷进行平板计数分析。

图4、S.Tmavir hyd3在天真的LCM和CON小鼠中定植能力受损。(A)八只天真的LCM小鼠或(B)七只天真的CON小鼠分别感染S.Tmavir或S.Tmavir hyd3（5×10?cfu，灌胃），在第1天p.i.测定粪便载量。

图5、引入氢气消耗者干扰S.Tm通过hyb途径的肠道入侵。(A)实验策略。(B)LCM小鼠预先定殖氢气消耗菌株S.Tmavir（实验组）或不能消耗氢气的突变体S.Tmavir hyd3（对照组）（5×10?cfu，灌胃，提前1天）。通过平板计数确认定殖效果。随后用S.Tmavir与S.Tmavir hyd3按1:1比例混合（5×10?cfu，灌胃）再次感染（每组5只小鼠），第1天p.i.测定竞争指数。

结论与展望

本研究利用小鼠沙门氏菌腹泻模型和转座子突变体筛选，发现沙门氏菌Typhimurium（S.Tm）在未扰动的肠道中的初期生长依赖于其hyb氢化酶，该酶能促进氢气（H?）的利用，而氢气正是肠道菌群代谢中的核心中间产物。在竞争性感染实验中，与野生型S.Tm相比，hyb突变株在感染早期的生长显著受限，但当抗生素破坏宿主菌群后，这一差异消失。此外向肠道菌群中引入消耗氢气的细菌也会干扰hyb依赖的S.Tm生长。因此，氢气作为肠道菌群代谢的“阿喀琉斯之踵”可以被病原体利用，同时也可能成为预防感染的新靶点。Unisense微电极被用于测量小鼠盲肠腔内的氢气（H?）浓度，以验证微生物群产生的氢气是否为鼠伤寒沙门氏菌（S.Tm）入侵肠道生态系统提供能量支持。研究人员通过unisense氢气微电极高精度的氢气浓度测量，为理解肠道微生物群与病原体之间的代谢相互作用提供了直接的证据。本研究揭示了氢气在鼠伤寒沙门氏菌入侵肠道生态系统中的关键作用，并指出氢气是肠道微生物群代谢的一个潜在弱点，可能被病原体利用。通过调节氢气的可用性，可以为预防肠道病原体感染提供新的策略。

丹麦Unisense微电极可穿刺水体、动物组织、生物膜、颗粒污泥、植物根茎叶、液体-固体扩散边界层，研究微区、微生态的研究系统，微电极穿刺系统可穿刺检测动植物组织器官/沉积物/水/土壤/底泥/生物膜/颗粒污泥等不同深度的nM级O₂、NO、N₂O、H₂S、H₂、pH、氧化还原电位、温度等指标变化。unisense微电极尖端最细可达几微米，不破坏被测点微环境，无损伤。