氢气微电极应用：光催化葡萄糖消耗和氢气产生用于糖尿病伤口愈合

糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，常伴有长期炎症、自主神经异常和细菌感染，使糖尿病创面难以愈合。高糖微环境在糖尿病创面的发生和进化过程中起着重要作用。通常高糖微环境会促进糖基化，导致一系列副作用，包括慢性炎症和血管损伤。氢分子已被证明是一种安全有效的抗炎剂，可改善缺血-再灌注损伤，激活皮肤细胞，促进伤口愈合。提出利用肿瘤、关节炎等疾病微环境中的还原性化学因子作为人工催化剂的牺牲剂，通过光催化途径实现可持续的、可控的制氢，以提高氢治疗的疗效。近红外(NIR)光催化有利于深部疾病的氢治疗，但近红外介导的光催化制氢效率普遍远低于紫外光(UV)和可见光(VIS)。与NIR光催化相比，VIS光催化制氢更适用于糖尿病创面等浅表疾病的治疗。

本论文研究人员研制了一种金红石单晶结构的含氢氧化钛纳米棒(HTON)，作为具有适当能带结构的可见光光敏光催化剂，利用葡萄糖作为牺牲剂实现VIS光催化制氢。光催化介导的局部葡萄糖消耗和产氢能够显著加速糖尿病创面愈合，为DFU的愈合提供了一种有前途的策略。此外所研制的HTON hydrogel敷料使用方便、安全，具有良好的临床转化应用前景。

Unisense微电极系统的应用

在模拟溶液中，使用氢气微电极(Unisense，丹麦)检测氙灯照射下在HTON上VIS光催化生成的氢。在葡萄糖溶液(20 mM)中加入HTON制备模拟高糖环境，最终HTON浓度设置为200μg/mL。将1ml配制好的溶液放入一个特殊的容器中，然后将氢气微电极（unisense）置于溶液上方，通过在黑暗中固定时间点照射溶液的氙灯反复开关来检测氢分子。收集的溶液稀释10倍后，使用葡萄糖测定试剂盒(Solarbio,BC2505)测定相应时间点的葡萄糖浓度。在体外，收集细胞上清检测VIS照射后的氢气的浓度，同时过滤细胞上清去除纳米颗粒，然后使用葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖浓度。

实验结果

研究了光催化治疗对糖尿病创面微环境的影响。由于基于HTON的光催化制氢和葡萄糖消耗具有抗凋亡、促增殖和促迁移的作用。糖尿病模型中CD31和VEGF的表达被抑制后迅速恢复，特别是在早期。这表明光催化抑制AGE-RAGE通路促进血管生成，支持糖尿病伤口愈合。设计并合成了一种具有金红石单晶结构的HTON。氢掺入对能带结构的调制使HTON具有可见光吸收和vis光催化活性，使糖尿病创面高糖微环境中的葡萄糖成为牺牲剂。通过hton介导的vis光催化，在体外和体内实现可控和可持续的葡萄糖消耗和产氢，共同减弱高糖的促凋亡作用，促进细胞增殖和迁移，支持糖尿病创面愈合。HTON+可见光具有良好的糖尿病创面愈合性能和较高的生物安全性，保证了HTON+可见光具有很高的临床转化潜力。

图1、基于HTON的可见光触发光催化治疗糖尿病创面机理示意图。

图2、HTON纳米催化剂的形貌、组成和尺寸表征。HTON的TEM图(a)、HR-TEM图(b)、XRD(c)、XPS图(d,e)、VSM图(f)、EPR谱(g)、FTIR谱(h)。a、b的实验独立重复了三次，结果相似。

图3、HTON纳米催化剂制氢和耗糖的能带结构和vis光催化行为。紫外-可见吸收光谱(a)，xps测定的TON和HTON的最高占据分子轨道(HOMO)水平(b)，HTON的Mott-Schottky图(c)，TON和HTON的能带结构(与正常氢电极(NHE))以及vis光催化制氢和消耗葡萄糖的机理示意图(d)，在不同功率密度氙灯照射下，HTON纳米催化剂在葡萄糖水溶液(20 mM)中的vis光催化制氢(e)和葡萄糖消耗(f)行为(n=3个生物独立实验)。

图4、基于葡萄糖消耗和产氢的光催化治疗的体外效应和机制。VIS光催化治疗糖尿病创面的机制示意图(a)，细胞内VIS光催化H2生成和葡萄糖消耗(n=3个生物独立样本)。(b)，体外细胞培养3天后晚期糖基化终产物(AGEs)(n=5个生物独立样本)及其受体(RAGE)(n=4个生物独立样本)的表达。(c)，vis光催化治疗对HMEC-1细胞增殖(n=4个生物独立样本)。(d)、凋亡(n=3个生物独立样本)(e,f)和(g,h)迁移(n=3个生物独立样本)的影响。采用TUNEL(末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP缺口末端标记)试剂盒中的荧光素标记三磷酸脱氧尿苷(dUTP-fitc)对e)细胞凋亡细胞进行绿色荧光成像。通过在h细胞边缘绘制白线来识别不同处理时间后的细胞迁移情况。l-抗坏血酸(AA)和四硫酸钠(STT)作为单个氢的空穴牺牲剂和电子牺牲剂分别产生和消耗葡萄糖。

图5、用HTON Gel建立糖尿病创面模型及治疗过程;a)糖尿病伤口的数字图像。b)相应的创面大小统计。c),在处理过程中(n=5个生物独立样本)，第7天和第14天提取的创面组织(d)苏木素-伊红染色法(H&E)和(e)马松三色染色法的图像。

结论与展望

糖尿病足溃疡(DFU)的高糖微环境引起过度糖基化，诱发慢性炎症，导致DFU难以愈合。富氢水浴在临床上可以通过氢分子的抗炎作用促进DFU的愈合，但长期每天浸泡不利于结痂的形成，不能改变高糖微环境，限制了DFU治疗的效果。本论文研究提出了利用高糖微环境中的葡萄糖作为牺牲剂，光催化治疗糖尿病创面，实现可持续的产氢和局部葡萄糖消耗。研制了含氢氧化钛纳米棒，实现了高效的可见光(VIS)响应光催化葡萄糖消耗和产氢，实现了糖尿病创面愈合的高效。局部葡萄糖消耗和氢生成分别通过抑制晚期糖基化终末产物的合成及其受体的表达，共同减弱皮肤细胞的凋亡，促进其增殖和迁移。提出了vis光催化策略为DFU的快速、安全、高效处理提供了一种解决方案。

丹麦Unisense公司是全球生产商品微电极的顶级公司，上海有限公司是丹麦Unisense公司产品在中国的总代理和技术服务中心，负责Unisense公司微电极产品的销售、技术培训和售后服务。与普通毫米级电极相比，Unisense微米级微电极具有独特的电化学性质：能刺入样品中、测量微环境、不破坏被测对象的结构和生理活性、在极短的时间内达到平衡、对流动不敏感等特点。