基于亚/超临界流体色谱
肽纯化方法的开发
SFC 应用
”
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简介
肽是一类特殊的药物生物制剂，表现出独特的治疗和生化特性[1]。基因组学、转录组学、蛋白质组学和蛋白质工程的进步导致了与体内内源性信号化合物（如神经递质）分子结构相似的肽的合成[2]。肽用途极其广泛，具有多种医学益处，包括抗病毒、抗糖尿病、抗癌和抗菌特性[3]。肽的物理化学特性是尺寸相对较小，同时表现出结构多样性、低毒性、高生物活性、高组织亲和性和特异性[4]。肽被推测是下一代处方量很大的药物，正如它们在治疗几种主要疾病中的常规应用所例证的那样[3]。
肽的大规模生产存在许多问题，例如合成成本高，尤其是纯化成本高[5]。目前，肽的纯化是使用一系列色谱方法实现的，包括反相高效液相色谱 (RP-HPLC)、尺寸排阻色谱 (SEC) 和离子交换色谱 (IEC)[6]。这些方法通常冗长且昂贵[7]。这是肽治疗剂生产过程中常见的重大瓶颈[5]。传统的分析分离每次运行会产生约 60mL 可能对环境有害的废物，并增加了运营成本[7]。另一个主要问题与这些化合物在纯化过程中的溶解度和稳定性有关[5]。因此，需要更绿色和环保的工艺[8]。
通过亚/超临界流体色谱 (SFC) 纯化此类化合物可能提供一个可能的解决方案，该技术近年来在制药行业势头强劲[6,9,10,11,12,13]。本质上，SFC 可以减少纯化过程中使用的有机溶剂量，因为它采用 CO? 作为主要流动相，从而在蒸发和分馏过程中消耗更少的能量[14]。在SFC上分离药物已被证明具有更高的效率、更快的运行时间和连续进样，从而允许更高的色谱生产率和减少溶剂浪费[6,9,15]。然而，SFC 纯化也存在缺点，例如，用于溶解分析物的改性剂与所用流动相不匹配，可能导致宽峰谱[9,16]。目前，关于生物分子（如蛋白质和肽）的 SFC 纯化信息有限。然而，Schiavone 等人最近进行了一项研究，报道了缓激肽（肽）和市售蛋白质（如牛胰岛素、泛素和细胞色素C）的成功制备规模 SFC 纯化[6]。上述研究采用了2-皮考基胺色谱柱，以 CO? 和乙腈与甲醇的混合物以及 5% H?O 和 0.2% 三氟乙酸 (TFA) 添加剂作为流动相[6]。然而，上述研究的潜在缺点是泛素、细胞色素 C 和脱辅基肌红蛋白的高阶结构在 SFC 纯化后未能保留。
Schiavone 等人得出结论，缓激肽和牛胰岛素可以使用该方法纯化，因为胰岛素的高阶结构在 SFC 后得以保留[6]。尽管 SFC 已迅速成为制药行业的终极纯化工具，但关于使用 SFC 进行重要肽靶标制备规模纯化的参考文献很少。Tognatelli 等人进行的另一项研究在分析规模上使用了 2-乙基吡啶色谱柱的 SFC，成功纯化了 G3502、V8376、乙酸甲硫氨酸脑啡肽、乙酸血管紧张素II和乙酸亮氨酸脑啡肽等肽的混合物，并使用 CO? 和甲醇作为流动相，添加 0.1% TFA[7]。最近，Ventura 概述了 SFC 在分离粗 therapeutic 肽和肽库方面的许多优势用法，其使用 Luna HILIC 固定相，结合甲醇和使用 TFA/氨水的混合添加剂方法[11]。Makarov 和 Regalado 最近通过在富水改性剂中引入氢氧化铵的离液效应机制，使得能够使用基于聚(4-乙烯基吡啶)的固定相 (Depak SFC-B, PAVP) 在分析和制备规模上分离环肽[10]。
药物开发过程中的一个主要瓶颈是极性混合物的纯化；因此，必须开发新的 SFC 技术，将 SFC 纯化扩展到更多极性分析物[9,10,17]。研究表明，向甲醇/CO? 流动相中添加少量水可通过改善分析物溶解度和有助于分离更极性分析物来增强 SFC 色谱[6,9,10,17,18]。因此，在我们的研究中，我们证明了将水与甲醇、TFA 和 CO? 流动相结合以实现粗肽 SFC 纯化的效果。
我们的研究旨在基于这一发展中的领域，通过评估分析规模上一些市售色谱柱的 SFC 技术，研究与糖尿病和心血管疾病相关的肽。选择以下分析物作为候选，因为这些肽常用于治疗非传染性疾病，包括一个四肽 [胰岛素β链肽 (15-18)]、一个八肽 [血管紧张素II] 和一个九肽 [胰岛素β链肽 (15-23)] [19]。这些粗肽在五氟苯基 (PFP)、二醇-亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 和 2-乙基吡啶 SFC 色谱柱上进行了评估，使用的流动相为工业级 CO? 和含有 0.2% TFA 以及 5% 水的甲醇。此后，对 SFC 纯化后的上述肽使用液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 进行了定量。
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材料与方法
2.1. 化学品与试剂
甲醇、乙腈、TFA 和甲酸购自（德国默克公司）。超纯水来自 Millipore Milli-Q Gradient（美国 Millipore 公司）水纯化系统。除非另有说明，所有其他溶剂和试剂均购自默克公司（德国）。粗肽（表1）购自 AnaSpec, Incorporated（美国）。
表1. 本研究中使用的粗肽的分子量和序列。
肽 | 肽长度 | 分子量 (道尔顿) | 肽序列 |
胰岛素 β 链肽 (15–18) | 四肽 (4) | 505.7 ± 0.2% | LYLV |
血管紧张素 II | 八肽 (8) | 1045.2 ± 0.2% | DRVYIHPF |
胰岛素 β 链肽 (15–23) | 九肽 (9) | 1008.3 ± 0.2% | LYLVCCERG |
2.2. SFC 仪器
SFC 系统（Prep SFC 30，步琦公司）由进样环、柱温箱（保持在40°C温度）、背压调节器 (BPR)（设定在 150 bar）、一个泵头保持在 5°C 的 CO? 泵（美国 Polyscience 公司数字冷却器）、一个用于改性剂的高压泵和一个紫外 (UV) 波长检测器（设定在 220 纳米 (nm)）组成。对四肽 (1 mg/mL)、八肽 (2 mg/mL) 和九肽 (1.5 mg/mL) 进行 50 μL 进样。本研究中使用的流动相是工业级 CO?（南非Afrox公司）和含有 0.2% (v/v) TFA 和 5% (v/v) 水（德国默克公司）的甲醇。使用 5-60% 的梯度，其中甲醇改性剂最初保持 1 分钟，在 6 分钟内升至60%，并再保持 5 分钟。总运行时间约为 13 分钟。对于2-乙基吡啶（10 mm 内径 (I.D.)）色谱柱，使用 8 mL/分钟的流速；而对于较小直径的色谱柱（4 mm I.D.），使用 4 mL/分钟的流速。采用以下参数评估 SFC 色谱柱性能，如重现性、峰形、高效的 SFC 肽分离和保留因子。馏分收集后，纯化的肽样品使用旋转蒸发仪（步琦公司）旋干，随后在 4°C 下储存以备进一步分析。对上述三种肽的 SFC 纯化进行了三次重复测试 (n = 3)，并计算了标准偏差和相对标准偏差。
表2. 本研究中使用的 SFC 色谱柱的物理尺寸。
色谱柱填料材料 | 尺寸 (长 × 内径) mm | 孔径 (?) | 粒径 (μm) | 供应商 |
PFP | 250 × 4.6 | 120 | 5 | YMC (日本) |
diol-HILIC | 250 × 4.6 | 120 | 5 | YMC (日本) |
2-乙基吡啶 | 250 × 4.6 | 100 | 5 | Princeton chromatography Inc. (美国) |
2-乙基吡啶 | 250 × 10 | 300 | 5 | Princeton chromatography Inc. (美国) |
2.3. LC-MS 监测
本研究采用 LC-MS-2020（日本岛津公司）监测肽。该仪器包括一个二元泵、一个自动进样器、一个单四极杆质谱仪和一个 NM32LA 氮气发生器（英国Peak Scientific Instruments 公司）。LC-MS 分析中使用的两种流动相是流动相 A：Millipore 水（美国 Millipore 公司）和流动相 B：乙腈（德国默克公司）。这些流动相均含有浓度为0.1% (v/v) 的甲酸作为离子对试剂（德国默克公司）。使用10 μL进样体积，用于粗四肽 (1 mg/mL)、八肽 (2 mg/mL) 和九肽 (1.5 mg/mL)。四肽使用 LC-MS 方法 A 进行分析，采用 5%-95% 的梯度曲线，其中乙腈在 18 分钟内从 5% 升至 95%。八肽和九肽使用 LC-MS 方法 B 进行分析，其中乙腈梯度在 22 分钟内变为 5-70%。两种方法的流速均为1.0 mL/分钟，使用不锈钢 YMC-triart C?? 色谱柱（日本 YMC 公司），其尺寸如下：粒径5 μm，内径 4.6 mm，长度 150 mm，孔径 120 ?。雾化器设定为 1.5 bar，去溶剂气温度设定为 250°C。MS 谱图在正离子模式下进行，质量范围从 200 到 1500 m/z。
2.4. 色谱柱
表2 说明了本研究中使用的所有 SFC 色谱柱的物理尺寸。
2.5. 粗肽的溶解度
粗胰岛素 β 链肽 (15–18) (四肽) 和血管紧张素 II (八肽) 分别溶解在纯甲醇中，浓度分别为 1 mg/mL和 2 mg/mL。然而，粗胰岛素 β 链肽 (15–23) (九肽) 需要约 96% (v/v) 甲醇、4% (v/v) 水和 0.16% (v/v) TFA 才能在 1.5 mg/mL 的浓度下完全溶解。
2.6. 肽回收率
在 Sepiatec Prep SFC 30 系统（步琦公司）上进行多次进样 (50 μL)。馏分收集后，将 SFC 纯化的四肽、八肽和九肽小心地放入旋转蒸发仪（步琦公司）中以减少甲醇量，随后使用步琦公司冷冻干燥机冷冻干燥过夜。
记录冷冻干燥肽样品的重量；肽回收率根据以下公式计算：
肽回收率=SFC 纯化后的肽重量/SFC 纯化前的肽重量×100%
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结果与讨论
肽和蛋白质的分离取决于各自溶质的差异吸附及其对固定相和流动相的亲和力，其结合亲和力程度取决于溶质的结构。当分子对特定固定相具有更高的结合亲和力时，与具有较低结合亲和力的分子相比，它在色谱柱上的保留时间更长[20]。正确选择理想的固定相对于这些分析物的分离至关重要。使用传统的流动相和固定相在 SFC 上，高度极性化合物（如核酸和氨基酸）的分析和纯化一直被广泛避免，原因是峰形差和保留时间长[6]。研究表明，该技术可用于分离和纯化强极性分子，通过向流动相中添加水以改善分子的溶解度、峰形并有助于减少固定相相互作用[6,9,10,17,18]。
本研究实施了使用含 0.2% TFA 的 5% 水与甲醇/CO? 混合作为流动相。评估了各种 SFC 色谱柱，以确定用于纯化粗四肽 [胰岛素β链肽 (15–18)]、八肽 [血管紧张素II] 和九肽 [胰岛素β链肽 (15–23)] 的最佳固定相。在 SFC 纯化前后，使用 LC-MS 分析检测和监测肽。
3.1. 粗四肽、八肽和九肽的 LC-MS 分析
粗四肽和八肽都能很好地溶解在纯甲醇中；然而，粗八肽需要更长的超声时间，并且需要添加 4% 的水才能完全溶解。在进行 SFC 纯化之前，通过 LC-MS 分析了粗四肽（图S1）、八肽（图S4）和九肽（图S7），以确认其分子量和纯度。粗四肽显示出两个主要峰（图S1）：一个分子量为 506.55 m/z，与四肽相关 (68.36%)（图S1和S2），另一个分子量为 612.54 m/z（图S1和S3），对应于一种杂质 (31.65%)，该杂质是购买的肽中存在的 Rink Amide 树脂肽合成的副产物[21]。粗八肽的 LC-MS 谱图显示一个主峰 (93%)（图S4和S5），分子量为 1045.66 m/z，以及几个靠近的小峰，最近的一个分子量为 605.24 m/z，对应于酪氨酸的双偶联物 (7%)（图S4和S5）。粗九肽 (92.59%) 的分子量为 1008.64 m/z（图S7和S8），有一个肩峰分子量为 1064.75 m/z（图S7和S9），对应于叔丁氧羰基保护基的杂质 (7.41%)。有了这些信息，我们在各种 SFC 色谱柱和条件下测试了这些肽，以进行优化纯化。
3.2. 肽的 SFC 纯化
使用以下 SFC 色谱柱评估粗四肽、八肽和九肽：PFP、diol-HILIC 和 2-乙基吡啶。在这些肽的 SFC 纯化过程中，在 SFC 色谱图上观察到 UV 波长检测器噪声（图1, 2, 3 和 4），这种噪声有三个可能的来源：(i) 流通池，这是电子、机械和热噪声，导致灵敏度降低[22]；(ii) 由于 SFC 的 BPR 导致的压力波动折射率变化[23]；(iii) BPR 阀门的打开和关闭可能导致系统内形成压力脉冲，这在图1、3和4中观察到。
3.2.1 四肽的 SFC 色谱柱优化
影响肽最佳分离和分辨率选择的因素包括特定肽的烷基链数量和总体分布、芳香族、不可电离、极性、羟基和带电基团，这些会影响肽的疏水性、电离和极化性[24]。四肽在上述 SFC 色谱柱上进行了测试（参见图1 A-D和表S1）。在 PFP 和 diol HILIC 上的峰形相对较好；然而，LC-MS 结果表明，SFC 纯化后的四肽含有混合物（四肽和来自粗样品的相同杂质），因此表明可能仅发生了部分纯化（图S10）。
四肽也在 2-乙基吡啶 100 ? 色谱柱上进行了分离，从所述的三个色谱柱中获得了最佳保留因子 (k) (5.51)，且峰形良好，基线噪声最小，无峰分裂（参见 表S1）。此后，选择 2-乙基吡啶 300 ? 色谱柱（图1-C）进行进一步分析，以评估固定相孔径对四肽纯化的影响，参见 图2 和 表S1，并在 SFC 后通过 LC-MS 分析确认（图S11和S12）。从 SFC 和 LC-MS 色谱图可以看出，大孔径固定相的纯化效率要高得多。
▲ 图1：代表四肽 (1 mg/mL) 在以下色谱柱上的 50 μL 进样的 SFC 色谱图：A: PFP (250 mm × 4.6 mm), B: diol-HILIC (250 mm × 4.6 mm), C: 2-乙基吡啶 (250 mm × 4.6 mm), D: 2-乙基吡啶 (250 mm × 10 mm)。所有色谱柱均在梯度模式下测试，改性剂范围为 5-60%，总运行时间约为13分钟。使用以下操作条件：温度：40°C，BPR 设定为150 bar。
▲ 图2：代表四肽 (1 mg/mL) 在2-乙基吡啶基色谱柱上的50 μL进样的SFC色谱图，该色谱柱具有以下特性：尺寸：250 mm × 10 mm，孔径：300 ?，粒径：5 μm。这是在等度模式下使用20%改性剂进行的，总运行时间约为13分钟。使用以下操作条件：温度：40°C，BPR设定为150 bar。
3.2.2 八肽的 SFC 色谱柱优化
粗八肽在上述 SFC 色谱柱上进行了评估；（参见 图3 A-D和表S2）。八肽保留在 PFP 色谱柱上未洗脱（图3-A）。PFP 色谱柱由五氟苯基键合相组成，该相含有带部分负电荷的氟原子，导致显著的离子、π-π 和偶极-偶极相互作用[25]。Diol-HILIC 色谱柱显示出较差的峰形和基线噪声（图3-B）。该色谱柱基于层状有机/无机杂化二氧化硅并用二羟丙基合成。Diol-HILIC 固定相包含键合在硅胶表面的丙二醇配体。还有未反应的残留硅醇基团[26]。这些硅醇基团本质上是酸性的；因此，diol-HILIC 色谱柱可以表现出阳离子交换特性[27]。SFC 后的 LC-MS 结果表明存在混合物，其中包括八肽和来自粗样品的相同杂质（图S13）。最初，对八肽使用了 2-乙基吡啶 100 ? 色谱柱，其显示出良好的峰形、最小的噪声且无峰分裂，该固定相被认为适合进一步优化（图3-C）。因此，我们继续评估该色谱柱的大孔径版本。2-乙基吡啶 300 ? 以更好的峰形和 2.63 的保留因子分离了八肽，因此值得进一步使用（参见 图3-D, S14, S15和表S2）。
▲ 图3：代表八肽 (2 mg/mL) 在以下色谱柱上的50 μL进样的SFC色谱图：A: PFP (250 mm × 4.6 mm), B: diol-HILIC (250 mm × 4.6 mm), C: 2-乙基吡啶 (250 mm × 4.6 mm), D: 2-乙基吡啶 (250 mm × 10 mm)。所有色谱柱均在梯度模式下测试，改性剂范围为5-60%，总运行时间约为13分钟。使用以下操作条件：温度：40°C，BPR设定为150 bar。
3.2.3 九肽的 SFC 色谱柱优化
粗九肽在上述 SFC 色谱柱上进行了类似的评估（参见图4A–D, S16-19）。PFP 和 diol-HILIC 色谱柱的分离不充分，存在峰分裂、峰分辨率差和部分分离的问题（参见图4和表S3）。在微孔色谱柱中，2-乙基吡啶100 ?色谱柱（图4-C）显示出最佳的保留因子和峰形，且噪声最小（参见 表S3）。因此，我们继续评估大孔径 2-乙基吡啶 300 ? 色谱柱（图4-D）的有效性，该柱显示出比其微孔对应物更好的峰形和峰分辨率，保留因子为 2.92。
▲ 图4：代表九肽 (1.5 mg/mL) 在以下色谱柱上的50 μL进样的SFC色谱图：A: PFP (250 mm × 4.6 mm), B: diol-HILIC (250 mm × 4.6 mm), C: 2-乙基吡啶 (250 mm × 4.6 mm), D: 2-乙基吡啶 (250 mm × 10 mm)。所有色谱柱均在梯度模式下测试，改性剂范围为5-60%，总运行时间约为13分钟。使用以下操作条件：温度：40°C，BPR设定为150 bar。
3.3. 在 2-乙基吡啶色谱柱上进行的 SFC 回收率
先前的研究表明 2-乙基吡啶色谱柱在 SFC 分离肽（如乙酸亮氨酸脑啡肽以及乙酸甲硫氨酸脑啡肽）方面是成功的，这由 Tognatelli 等人[7]报道，并且 Ventura 等人[11]也报道了用于专有的大环肽。在我们的研究中，四肽、八肽和九肽证实了这一点（图1-C, 3-C, 和4-C）。大分子（如肽）需要更大孔径的色谱柱以确保分析物可以接触到内表面（孔径通常≥300 ?）并不少见[28]。大孔色谱柱的范围约为 100-4000 ?[29]。这些色谱柱还允许进行更好的放大，因为它们能够使用更高的流速和通量，以及处理更大样品量的能力，从而提高了肽分离的效率。四肽 [胰岛素 β 链肽 (15–18)]、八肽 [血管紧张素II]、九肽 [胰岛素 β 链肽 (15–23)] 在 2-乙基吡啶色谱柱上的分离具有重现性，相对标准偏差值为 0–0.02%（见表3）。标准偏差和相对标准偏差表明该方法具有良好的精密度[30]。因此，选择2-乙基吡啶色谱柱 (300 ?) 进行进一步评估，对三种粗肽进行了放大肽回收率测试（参见表4，图S20, S21, 和S22）。九肽的回收率最佳，为 102%，其次是八肽，为 100%，四肽为 80%。四肽回收率与其他两种肽不同的可能原因是四肽含有更多杂质 (31.65%)，而八肽和九肽的杂质均约为 7%。这些结果与 LC-MS 结果中观察到的杂质相关（第3.1节）。
由于稳定性差和溶解度差，肽的纯化可能存在问题，导致肽产率低。研究表明，向 CO?/甲醇流动相中添加少量水可通过改善化合物溶解度、峰形、实现更好的分离、减少运行时间来实现 SFC 色谱的增强，并且由于消耗的有机溶剂更少，使得 SFC 纯化过程更环保[6,9,10,17,18]。在我们的研究中，我们证明了将水与甲醇、TFA、CO? 流动相结合以实现上述肽的 SFC 纯化的效果，因此发生的稳定性问题极少。有趣的是，本研究的总运行时间为 13 分钟，每次运行产生 29.24 mL 废物，而传统的分析型 RP-HPLC 方法需要 50 分钟，每次运行产生约 60 ml 废物[7]。这种运行时间分析的减少对产生更少的废物具有影响，从而减少了对环境的影响。
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实验结果与讨论
在分析规模上评估了三种不同 SFC 色谱柱（PFP、diol-HILIC 和 2-乙基吡啶）对四肽 (LYLV)、八肽 (DRVYIHPF) 和九肽 (LYLVCCERG) 的 SFC 纯化。使用LC-MS分析检测和监测了三种肽的纯度。2-乙基吡啶固定相对这些肽被证明是最佳的，因为它显示出良好的峰形和分辨率。使用这种固定相，SFC 纯化方法对所有三种肽都具有重现性和精确性，观察到的低相对标准偏差范围在 0–0.02% 之间。回收率范围在 80% 至 102% 之间。应注意的是，传统的肽纯化方法大约需要 50 分钟，而 SFC 方法将运行时间减少到大约 13 分钟。所用溶剂量显著减少，使其成为一个更环保的过程。在肽药物纯化过程中会遇到许多挑战，例如稳定性和溶解度。由于当前文献中关于肽和蛋白质 SFC 纯化的信息有限，本研究提供了一个必要的方法开发策略。本研究包括在 CO?/甲醇流动相中使用水和 TFA，以及避免使用有毒的乙腈，因此为其他肽提供了一个重要的概念验证起点。未来的研究可以侧重于在更大的制备规模上使用 SFC 纯化，研究更高分子量的肽/蛋白质，改变流动相，并考虑使用定制色谱柱。
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参考文献
瑞士步琦
BUCHI 集团是实验室蒸发、提取、浓缩、纯化、干燥及化学合成等前处理和分析技术的市场领导者。旋转蒸发仪、平行蒸发仪、喷雾干燥仪、冷冻干燥、固液萃取仪、中压/高压制备液相色谱、超临界流体色谱、二维液相色谱、凯氏定氮系统、熔点测定仪、近红外光谱仪等相关产品构成了 BUCHI 实验室前处理与分析技术的产品线。同时，BUCHI 还提供从便携式，实验室到在线过程近红外分析的全套解决方案，确保数据的准确性与可靠性。BUCHI 与全球广大科学家进行着密切的合作, 支持其在科研道路上不断探索。我们致力于为客户提供智慧实验室整体解决方案, 帮助客户获得成功。
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