核心解读 | 动物疫病高通量测序专家共识

过去几十年来，禽流感、非洲猪瘟、口蹄疫等动物传染病给畜牧业造成了重大损失，同时动物来源的传染病病原体对食品安全和公共卫生健康构成了严重的威胁。据世界卫生组织报告，全球新发传染病中约有60%的传染病和75%的新兴人类病原体来自动物。有效监测、控制动物病原微生物的发生对维护人类、动物和生态系统“同一个健康”至关重要。

1. 可用于检测生物材料(如诊断或监测样品)、培养物或分离物中的感染因子及其特征;

2. 也可以作为一种确诊方法，确认在其他初筛中检测到的生物，或提供其他特征分析;

3. 检测、鉴别此前从未鉴定过的微生物，并进行特征分析;

4. 提高已知疫病的诊断水平;

5. 提高由已知或未知病原造成的新发或再发疫病的诊断水平;

6. 开发单一的“通用”诊断技术，鉴定任何潜在病原体;

7. 对于多因子混合感染的疫病，同时快速检测多种病原体;

8. 在农场、地方、国家和全球等层面，提高研究病原体进化动力学的能力;

9. 更深入地了解传染病的流行病学和感染因子的亲缘地理学;

10. 加强传染病和病原体传播模式的可追溯性，包括在法医流行病学中的应用;

11. 更全面地了解已知病原“群体”(如相关次要流行株、逃逸变异株等)的特性，有助于开发更好的疫苗、抗病毒制剂等;

12. 通过对一个病原体的多个毒/菌株(包括参考株)进行全基因组测序，更好地建立起病原基因型和表型之间的关联。

• 生物安全与资质：实验室需达到生物安全二级（BSL-2）及以上标准，并具备相应的行业资质，确保实验操作符合国家法律法规。

• 结构布局：实验室需明确划分为湿实验区（样品处理、核酸提取、文库制备、测序）和干实验区（生物信息分析），并保证人员、试剂、耗材的单向流动，以防止交叉污染。

• 人员配置：要求实验人员具备分子生物学和微生物学专业技能，数据分析人员具备生物信息学背景，报告审核人员则需有丰富的兽医临床经验。

• 测序平台选择：实验室可根据需求选择第二代（NGS，优势在于高通量、低成本、高准确性）或第三代（TGS，优势在于长读长、实时测序、设备便携）测序平台。

• 样品采集与制备：强调样品采集的无菌操作和代表性，推荐选择感染部位的体液或新鲜组织。不同类型的样品（如全血、组织、拭子、粪便等）有明确的采集量、储存条件和处理规范。

• 核酸提取：建议使用经过验证的核酸提取试剂，根据测序目的选择 DNA、RNA 或共提取方法，确保核酸的纯度和浓度满足建库要求。

• 文库制备与上机测序：需根据测序平台选择合适的建库方法，并对文库质量（片段大小、浓度、纯度）进行严格质控。测序完成后，需确认碱基识别质量、有效数据量等指标符合要求。

• 数据库建设：《共识》强调了数据库的核心作用，建议实验室在公共数据库（如 NCBI）基础上，自建或使用包含临床流行毒株信息的动物病原微生物专用数据库，并定期更新维护，以提高比对的准确性。

• 数据分析流程：明确了从原始数据到最终报告的完整分析步骤：

• 文库质量控制

  实验室应根据测序目的、测序方法、测序长度等因素选择合适的建库试剂。每批文库都应进行质量评估，插入片段大小、单个文库浓度、混合文库浓度等指标符合测序仪上机要求后才能再进行下一步测序。

• 测序数据质量控制

  动物病原微生物宏基因组高通量测序数据，建议二代测序碱基识别质量Q30≥90%，每个样品的序列数≥10M(10million);三代测序Q10≥80%，每个样品的数据量≥1Gb(1Gbase)。

• 性能验证

  宏基因组高通量测序需要通过质控品和临床样品对全流程的湿实验和干实验进行性能验证，确认方法的符合率、检出限、重复性、准确性等性能参数，符合实验室对病原微生物测序能力的要求。

• 结果判定标准：建议将测序获得的微生物序列数进行归一化处理（如 RPM 或 RPTM），并结合阴性对照、样品信息和临床症状制定判定阈值（建议检出 3 条序列且覆盖 3 个非重复区域）。

• 报告内容与解读：报告应包含物种信息、序列数、覆盖度、相对丰度及质控数据等关键信息。最重要的是，结果解读必须结合患病动物的临床症状和流行病学信息，避免单纯依赖测序数据下结论。