糖化抗体分析中的色谱柱选择

抗体在细胞培养过程中，培养液中的葡萄糖与抗体的丝氨酸残基、苏氨酸残基结合而引起糖基化反应(Glycosylation)，以及与赖氨酸残基产生Schiff碱反应而发生糖化反应(Glycation)。这些反应的性质，与抗体中Fc片段含有的寡糖链的性质不同，与抗体的药效、生理活性等没有直接关系。

但是，抗体分子在细胞外与糖结合引起翻译后修饰变异，表明了抗体结构的不均一性，而在抗体药物上，这些变异体被认为是产品相关杂质，是需要分析其特性的。

分析糖化抗体一般采用硼酸亲和层析法。在不少文献中都有使用亲和色谱柱TSKgel Boronate-5PW来分析糖化抗体以及生物类似药的实例。

在该文献中，使用了TSKgel Boronate-5PW来分离和定量糖化抗体与非糖化抗体。从下面的色谱图中可以看到，糖化抗体会被色谱柱吸附，非糖化抗体则直接流穿出来。

抗体发生糖化反应时，葡萄糖等物质与抗体表面的氨基酸残基结合。这些糖带有平行排列的2个羟基 (-OH；二醇基)，在碱性洗脱条件下，二醇基与硼酸结合。TSKgel Boronate-5PW利用了这个原理，把硼酸化合物键合在凝胶固定相上。

硼酸亲和层析的原理示意图

Boronate-5PW的使用注意事项

● 使用碱性pH的缓冲溶液。可以使用pH 8左右的HEPES缓冲溶液。但是，Tris等碱性缓冲溶液、铵盐不可作为单一溶液使用。

● 确保有足够的初期平衡时间(≥10CV)。

● 样品吸附较弱时，向洗脱液中添加20-50 mmol/L的MgCl₂，有时可以让结合更加稳定，从而增强吸附能力。

● 洗脱分离受温度影响较大，为了获取再现性数据，请使用柱温箱，在稳定的温度下进行分析。