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天美讲堂丨细数显微拉曼光谱仪的那些“奇思妙想”

来源:天美仪拓实验室设备(上海)有限公司 更新时间:2024-07-24 17:45:12 阅读量:243
导读:显微拉曼光谱仪是一种分析样品化学成分的神奇技术,具有非破坏性,避免了样品复杂的前处理以及染色过程。

显微拉曼光谱仪是一种分析样品化学成分的神奇技术,具有非破坏性,避免了样品复杂的前处理以及染色过程。显微拉曼光谱仪将拉曼光谱与显微镜相结合,获得高空间分辨率,可用于几微米的颗粒样品测试。半导体、生命科学领域等多种应用场景中,显微拉曼光谱仪有着广泛的应用。

显微拉曼光谱仪的光路示意图

激光器部分(红色);显微镜部分(绿色);光谱仪部分(蓝色)

显微拉曼光谱仪的工作“解密”

显微拉曼光谱仪是一个复杂的系统,由多个部分组成:光学显微镜、拉曼光谱仪、激光器和检测器,如CCD(电荷耦合器件)相机。需要根据不同的应用场景,选择合适的配置。

激光器




激光器(光源)是显微拉曼光谱仪中最重要的组件,通常在仪器配置时需要首先考虑。激光器的作用是激发样品,产生拉曼光谱的分子振动。

显微拉曼光谱仪使用的激光器范围通常从紫外到近红外。两种最常用的波长是532nm和785nm。

两个波长(532nm和785nm)的激光器涵盖了从工程材料到生物学领域的大多数应用。例如,532nm的绿色激光器常用于材料方向(分析碳基样品时可以运用共振拉曼散射);785nm的红色激光器提供了拉曼散射强度和荧光背景干扰之间的最佳平衡。(当选择激光波长时,需要综合考虑很多因素。)
拉曼散射强度与λ?4成正比,其中λ表示激光的波长。因此,随着激光波长的增加,拉曼散射强度会减小。例如,紫外激光器提供的拉曼信号强度是近红外激光器的15倍。532nm的激光器激发的样品会产生比785nm的光激发样品,更强烈的拉曼散射信号。
如果只考虑信号强度,532nm的激光器会有极大的优势。但激光的波长并不是唯一的考虑因素。如果样品具有荧光特性,在测试样品时,需要使用785nm的激光器,而不是532nm的激光器。当532nm激光器激发样品时,会观察到高荧光背景,覆盖拉曼散射信号。此时,光谱图中的峰会变成一个大的、宽的、强度极高的峰(这会使检测器饱和)。较少的分子吸收近红外光,使用这个范围内的激光激发样品,可以有效避免荧光干扰,并显示拉曼峰。如果使用软件功能帮助减少荧光干扰,在荧光强度非常高时,这种解决方法是有局限性的。
使用绿色激光器激发样品时,提供高拉曼散射,允许更低的曝光时间和更短的实验时间。在测试绿色激光激发时表现出大荧光背景的样品,需要选择具有较低拉曼散射强度和较长实验时间的红色激光。
激光对样品的影响也是需要考虑的因素。长时间的曝光会增加样品损坏的风险,用红色激光激发样品更有可能烧毁样品,在测试这样的样品时,绿色激光成为更安全的选择。
通过降低激光的功率可以降低样品灼烧的危险,但这也会降低散射强度,而红光激光器的散射强度已经相对较低了。一般来说,绿色激光更适合分析材料和无机样品,而红色激光更适合分析生物样品。
要点提示:
1.532nm激光器比785nm激光器会产生更高的拉曼散射效应;
2.增加激光波长可以降低荧光背景干扰的风险;
3.绿色激光器适合用于材料分析,红色激光器适合生物科学方向的研究。

共聚焦显微系统




将拉曼光谱仪与显微镜结合,以高空间分辨率对样品进行可视化和进一步研究。拉曼扫描,也称为拉曼成像,为多样品点分析提供了优势。可以提供对样品内部组成的分布和异质性的信息,用于跟踪药物中的活性药物成分以确保药品质量,或扫描半导体晶圆以查找缺陷。拉曼成像可以体现出在单点样品光谱中可能不明显的微观特征信号,充分的数据信息可以进行统计分析,帮助识别样品内的趋势、模式和相关性。

使用显微镜和电动样品台,样品可以进行拉曼扫描,建立拉曼成像。显微共聚焦针孔位于光路上。针孔提高了空间分辨率,增加了图像对比度,减少了荧光背景效应。共聚焦针孔阻挡任何非聚焦光进入光谱仪,防止不必要的散射或荧光到达检测器。
共聚焦针孔进一步提高了激光在z轴上的精确聚焦。允许用户自由地测试样品的表面信息;以及进行三维样品检测,允许对单个样品层进行3D扫描。
显微镜允许配置许多物镜,每个物镜用于将激光聚焦到样品上并收集产生的拉曼散射。物镜有两个重要参数:放大倍率和数值孔径(NA)。增大放大倍率和NA可以提高空间分辨率。但,增大放大倍率会减小视野范围。样品的大小及其需要的分辨率是目镜选择的考虑因素。
要点提示:
1.共聚焦针孔有助于优化空间分辨率;
2.共聚焦针孔有助于在Z轴方向的测试;
3.更高的放大倍率和数值孔径物镜增加分辨率,但降低视野宽度。

光路




光路是指样品在激发后的拉曼散射方向(路径)。如前所述,针孔在光路内,截止滤光片也在光路通道内(它可以防止瑞利散射进入光谱仪)。瑞利散射无法提供有用的样品信息,会妨碍拉曼散射的信号。

边缘滤光片轮是用于捕获和观察拉曼散射的光学器件,是一种长通滤光片,可以吸收所有波长直至其光谱“边缘”。例如,选择边缘为532nm的滤光片用于532nm激光器。滤光片吸收532nm及以下的光,其中包括该波长的瑞利散射。任何波长长于532nm的光都将通过滤光片传输到光谱仪部分。
具有不同边缘锐度的滤光片可以实现不同的光谱范围。标准滤光片允许从~50cm?1观察拉曼峰,对于一些特定的应用,低波数滤光片可以观察到从5cm?1起始的峰值,也有更高的波数起止的选项(更便宜的解决方案),但必须注意:不要滤除300~1900cm?1之间光谱指纹区域。

滤光片要点提示:

1.强瑞利散射不能提供有用的样品信息;
2.边缘滤光片阻挡了光谱仪的瑞利散射;
3.边缘滤光片的锐度决定波数开始的位置。

光谱仪




光谱仪集成了光栅、摄谱仪和检测器等组件。在显微拉曼光谱仪中,衍射光栅将拉曼散射的波长分离并投射到具有不同像素的检测器上。衍射光栅之间的主要区别是它们的刻线密度。具有较高刻线密度的光栅提供了更高的光谱分辨率。然而,光谱仪的光谱范围与光栅的刻线密度成反比,这意味着较高的刻线密度也会降低光谱仪可以实现的光谱范围。

光栅选择的另一个因素是闪耀波长,它指的是衍射效率最高的波长。不同的光栅可以与特定的激光器配对,以提高衍射性能。
如何配对这些组件需要一定的理论考虑,例如:光谱分辨率随着激光激发波长的减小而降低。因此,当使用785nm激光器时,达到与532nm激光器相同光谱分辨率,使用低刻线密度的光栅即可。
光栅也有一个工作波长范围(色散与波长有关)。刻线密度为n的光栅的理论波长极限计算为λ=2/n。因此,当与532nm激光器配对时,2400刻线/mm的光栅将提供高光谱分辨率,但由于光谱范围有限,它不适合与785nm激光器一起使用。
被光栅分光后,拉曼散射信号通过光谱仪。光谱仪的焦距也会影响系统的光谱分辨率:焦距越长(光的分散性越好),光谱分辨率越高。当光传播距离较长时,拉曼散射强度会降低。台式共聚焦显微拉曼使用200至250nm的光谱仪焦距。当用紫外线激发或样品需要非常高的光谱分辨率时,需要增加焦距(如大于500nm)。
光谱仪中检测器将收集到的光子转换成有意义的信号,提供样品分子结构的定性和定量信息。从实用的角度来看,检测器的选择通常依据显微拉曼激光部分。电荷耦合器件(CCD)是拉曼显微镜中典型的检测技术,这些硅基多通道一维或二维阵列探测器能够快速捕获整个光谱。CCD内的每个通道都是一个光电二极管像素(其中有几千个像素),产生的电子电荷与吸收光子的数量成正比。因此,在一定的时间内到达CCD像素的光子越多,或者光子照射像素的时间越长,电荷会越多,检测到的信号就越强。
有两种类型的CCD:前照式和背照式(区别:入射光子如何到达光活性区)。在前照式的结构中,光子撞击与栅极电极在器件的同一侧,栅极电极可以吸收或反射入射的光子。这种方法限制了到达光活性区域的光子数量,量子效率被限制在最高60%。
背照式CCD结构中,光子透过薄薄的硅层到达传感器的背面,可实现的较高的量子效率(高达95%),但背照式CCD在检测时会存在光干涉的风险(近红外区域)。一般来说,背照式CCD适合于可见光激发,而在近红外范围内激发样品时,建议选择前照式CCD。
要点提示:
1.高刻线密度的光栅有利于提高光谱分辨率,但降低了光谱范围;
2.较长的焦距有利于提高光谱分辨率,但降低信号强度;
3.前置式CCD适用于785nm的激发;
4.背照式CCD适用于532nm的激发。

总结

在获得拉曼光谱的过程中,光从激光器进入显微镜,通过光路,并最终进入光谱仪时,多个组件发挥作用。确定显微拉曼光谱仪的最佳配置是具有挑战性的。样本和具体的实验需求都是需要考虑的因素。理想的显微拉曼光谱仪将为用户提供足够的通用性,以适应各种实验需求。

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