ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)特性的早期评估对优化和预测新的化学实体的药代动力学起着至关重要的作用,已成为现代药物发现的关键部分。化合物由于ADMET性能差而频繁失效,需要更早地对ADMET特性进行分析,其中最重要的ADMET试验是体外药物代谢稳定性试验。代谢稳定性一般用来描述化合物代谢的速度和程度, 其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。由此,代谢稳定性研究常作为早期化合物筛选的重要环节,其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率和预估剂量等具有重要意义。由于越来越多的化合物需要代谢稳定性评估,因此在早期药物发现中需要高通量和具有成本效益的方法。
Echo声波移液器
在这里,我们提出了一种小型化、简化和自动化的方法,使用声波液体处理器Echo来完成纳升级的小体积移液(最小体积2.5nL),实现化合物测试体积的微小化处理,数十上百倍的缩小体积,节约试剂成本。
Echo液体处理器采用变革式的移液方式,非接触式移液,无需接触和使用吸头、喷嘴或导管等工具,极大减少了吸头的消耗,节约耗材成本。
Echo 声波液体处理器可以精确准确地完全无接触地转移纳升液滴,以避免任何可能的污染。移液速度可达每秒钟200-500次微滴,而且可进行任意孔到任意孔的移液。各种试剂的快速转移使得能够评估大量化合物的ADMET性质。
Echo声波移液器移液动画视频
在用肝微粒体进行代谢研究时,加入相应的辅助因子NADPH,可重组体外代谢体系,从而通过体外温孵法进行Ⅰ相代谢稳定性研究。将受试物分别与肝微粒体共孵育,用384孔板进行批量处理,然后使用LC-MS/MS进行样品分析,通过检测受试物在不同时间点与T0的剩余量比值计算半衰期T1/2和清除率CL来描述受试物在肝微粒体中的代谢稳定性。
小型化代谢稳定性测试方案
代谢稳定性测试孵育体系包含:磷酸盐缓冲液,NADPH再生系统,肝微粒体蛋白;合适浓度的待测物。于37°C水浴孵育,以不包含NADPH发生系统的样品作为阴性对照。预设的反应时间点0,5,10,15,30,60 min后加入预冷的乙腈终止反应。采用LC-MC/MC测定温孵液中待测物和其代谢产物。测试中的5μL人肝微粒体(HLM)和2.5nL待测化合物使用Echo声波移液器完成移液,通过将受试物在不同时间点与T0时间点数据归一化转换为剩余药物百分比。然后使用化合物剩余百分比对数与孵化时间做线性回归,计算得到斜率-K。半衰期的T?=0.693/K。下图显示了四种测试化合物的斜率测定。
4种化合物的斜率测定
代谢稳定性研究是ADMET研究在早期先导物优化过程中的重要组成部分,可对体外代谢途径快速了解,并对潜在的药物相互作用给出指示。传统的分析方法使用更大的反应体积(100-200μL),这增加了大规模筛选的成本。使用Echo液体处理器,代谢稳定性测试的反应体积每个反应只需要2.5 nL的化合物和5 μL的人肝微粒体,这带来显著的试剂节省。
在本研究中获得的半衰期和内在清除率与使用更大反应体积的传统程序一致。有了Echo声波液体处理器,科学家们可以以一种可靠、快速和经济有效的方式来评估药代动力学参数。
小型化反应体系测得内在清除率与文献报道一致性好
在这个应用说明中,我们讨论了Echo声波液体处理器如何为进行小型化高通量代谢稳定性分析提供一个平台。声波液体处理器以完全无接触的方式传输纳升的体积。因此,可以用基于此项先进的液体处理方法缩小所需的体积的同时还能获得高质量的数据。
精密实现测定微量化:
非接触式无污染移取低至2.5nL的试剂量,使测试体系缩小几十倍、甚至上百倍。
实时调整移液参数:
动态流体分析实时调整移液参数,在没有用户干预的情况下,对流体类型、体积或性质的变化进行自动调整。
快速处理更复杂的问题:
任意孔之间的高通量移液,可快速实施高度复杂的多组分测定和实验。
提高数据质量:
纳升移液能力可实现直接稀释,即根据剂量响应曲线或标准曲线加入样本,而不是传统的连续稀释法,避免沿曲线传递误差(残留)的风险。
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