高光稳定性重氮氧三茂染料的无背景荧光衰减时间传感和pH成像

（论文部分内容摘抄）

新型荧光重氮恶唑烷胺(DAOTA)pH基于寿命的自参考pH传感的指标的报告。DAOTA染料被酚受体基团修饰，通过光致电子转移机制诱导荧光猝灭。吸电子氯取代物确保在最相关的pH范围内(p，p-二氯苯酚和p-氯苯酚取代染料的表观pK'a值分别为5和7.5)的应。荧光寿命长(17-20ns)，量子产率高(60%)，光稳定性好。将染料固定到聚氨酯水凝胶D4中制备平面光催化剂。除了荧光强度的响应外，该光学元件还表现出pH依赖的寿命行为，这使其适合于借助荧光寿命成像技术研究二维pH分布。对于具有高染料浓度(0.5-1%wt.)的传感器，寿命响应尤其明显。相对于聚合物)，并归因于高效的均FRET机制。

许多生物和生态系统是建立在广泛的不同参数之间的微妙平衡基础上的。其中最重要的是pH值，它在生物学、生物技术、医学、海洋学和环境监测等极其重要。为了监测这些地区的pH值，荧光化学传感器被证明是很有前途的分析工具，因为它们不受电磁干扰，能够进行无创测量，并且有各种形式可供选择，从平面光学传感器和光纤传感器到纳米颗粒。与其他方法(例如电化学传感)相比，光学传感器能够对pH进行成像表面上的分布(借助平面光管)或体积上的分布(借助纳米颗粒)。特别是，平面光管已被应用于海洋沉积物pH梯度成像，2.3根际，45生物膜，6伤口8号和微流控芯片。

图为新型pH敏感DAOTA染料的合成及传感机理的指示剂方案。

FD-FLIM 成像：

用德国PCO的pco.flim相机在频域内工作，进行了成像实验。激光源488nm的半导体激光器(PhoxXplus 488-200的pco.flim)，被调制在15 MHz的调制频率(方波调制)。平均激光功率为100毫瓦。使用尼康公司的显微镜软件进行数据采集和处理。为了进行微观测量，将直径为5毫米的传感器点从传感器箔上切下来，并粘在黑色96微孔板上。 图像获得与尼康显微镜配备一个尼康的目镜和0.7x相机适配器安装在相机上。该滤光立方体包括激励带通滤光器、二色镜和发射长通滤光片。使用染料掺杂板作为寿命标准(t=3.75 ns)。为了进行宏观测量，传感器箔用环氧胶固定在开放式微流控芯片聚合物的通道中。

图为PhOHCl2-DAOTA的平面光器件在D4(1%重量)中的pH的FLIM成像。

(a)：在显微成像实验中得到的荧光寿命(读出面积~0.9x0.9mm)的pH依赖性。对每个pH值在>3个不同的点上测量；

(b)：具有集成传感器箔微流体芯片图像；

(c)和(d)：对于同时用pH6.5和5.0的缓冲液冲洗的微流控芯片，分别产生衰减时间和pH分布的虚假彩色图像;速度最小21毫升。

这项工作中，我们提出了新的荧光pH指示剂的合成和表征的基础上重氮氧三棱柱染料。染料被合理地设计为既具有pH敏感性非共价固定到水凝胶基质中的功能性和疏水性锚定基团和纳米颗粒。染料在光谱的绿橙色部分具有吸收和发射的特征。且具有优异光稳定性。重要的是，pH指示剂保留极长的荧光衰减时间能够在时间分辨测量中有效地消除自发荧光。

氯化酚被证明是优良的受体，它能够通过光诱导电子转移调节pH值。以单氯化和二氯化部分装饰的染料具有大不相同的pK'a值，因此使潜在应用具有高通用性。出乎意料的是，我们发现固定在聚氨酯水凝胶和聚合物纳米颗粒中的指示剂的荧光衰减时间与pH有很强的依赖性。这种行为依赖于浓度，而且在溶解指标中没有观察到，这被归因于同性恋FRET。寿命测量的自参考特性使得新材料在 pH传感和成像方面特别有吸引力。

德国Excelitas PCO公司pco.flim型号相机，具备高分辨率、高感光度、弱光成像的优点，将显微研究实验过程完美记录，为实验提供强而有力的图像数据支持。

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