常见定点突变方法分析与对比

基因定点突变是目前生物学和基础医学研究中的重要实验技术，是改造、优化基因的便捷方案。对已知DNA片段的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，可用于研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系。

目前基因突变主要使用PCR介导的突变引入技术，常见的基因定点突变方法有重叠延伸PCR 法和滚轮扩增法，各方法有利有弊。

图1. 基于重叠延伸PCR的定点突变实验流程

常规重叠延伸PCR需设计一对涵盖突变位点的引物进行两轮PCR，第一轮PCR由正向外侧引物与突变引物合成片段1，由另一突变引物与反向外侧引物合成片段2；第二轮PCR利用两个片段作为模板扩增出含突变位点的全长基因。该方法最大的缺陷是操作相对繁琐，两轮PCR扩增和频繁的DNA回收操作会提高原始质粒污染的风险，并且第二轮PCR受影响因素较多，有时反复调整PCR反应条件也不能获得目标基因。

图2. 基于滚轮扩增原理的定点突变实验流程

基于滚轮扩增原理的定点突变方法需设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用DNA聚合酶扩增，获取的扩增片段完成5‘端磷酸化后在DNA连接酶的作用下环化，原始质粒在DpnI的酶切作用下被消化，最终获得突变质粒，该方法的缺陷在于7-10 Kb全长质粒的扩增往往不顺利，若不彻底消化原始质粒也容易产生假阳性克隆。同时，若需要完成多位点的定向突变，则需要花费更多的时间精力以及试剂成本。

图3. 基于同源重组技术的定点突变实验流程

目前市面上还存在着一种基于同源重组技术的定点突变方法，该方法需要在反向PCR引物中引入同源臂和突变位点，获取的产物在剔除掉原始模板后，于重组酶的作用下发生同源重组形成全长目的基因。该方法应用范围广，可进行单点、多点突变以及插入缺失等等，扩增的片段长度更长，可满足十几Kb全长基因的扩增需求，所要花费的时间精力等成本更少。
 

三种定点突变方法比对

翌圣生物匠心研发的定点突变试剂盒基于Hieff Clone® 快速克隆技术的定点突变系统，目标质粒扩增产物经DpnI消化、Hieff Clone®重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。高效快速的实现直接对目标质粒中的靶位点进行单点突变，多点突变，以及插入或缺失等。