电注射法导入外源基因获转基因水稻植株

一、引言

二、材料与方法

（一）实验材料

1. 水稻品种：选用生产中广泛种植、综合性状优良但对抗盐碱性稍弱的粳稻品种 “XX”，其组织培养再生能力经前期验证较稳定，利于后续转化操作及植株再生流程。

2. 外源基因：靶向提升水稻耐盐碱能力，选取来自耐盐植物盐芥的关键耐盐基因 TsVP，该基因编码液泡膜 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，能高效调控细胞内离子平衡，有效缓解盐分胁迫。基因两端精准添加适用于植物表达的强启动子 CaMV 35S 及终止子 NOS，确保基因在水稻细胞精准、高效转录与翻译；同时引入潮霉素抗性基因（hpt）作筛选标记，辅助后续转化体筛选。

3. 试剂与培养基：基础培养基为 MS 培养基，按需精准调配大量元素、微量元素、维生素及有机附加物，依实验阶段分别添配 2,4 - D（2,4 - 二氯苯氧乙酸）诱导愈伤组织、6 - BA（6 - 苄氨基嘌呤）促进芽分化、NAA（萘乙酸）助力根生成；电注射缓冲液选用含适量甘露醇、氯化钙的低离子强度溶液，维持细胞渗透压与膜稳定性；潮霉素、头孢霉素等抗生素用于筛选培养，抑制杂菌、非转化细胞生长。

（二）实验仪器

1. 电穿孔仪：选用精密可控、脉冲波形多样的专业型电穿孔设备，能精准输出方波、指数衰减波等电脉冲，电压范围 0 - 2000 V，电容可在 1 - 500 μF 灵活调节，精确设置脉冲时长（1 - 100 ms），适配水稻细胞电注射参数摸索需求；电极材质为铂铱合金，确保导电性能优、化学惰性强，电极间距依样本容器规格设 2 - 4 mm 多档可选，保障电场均匀施加于细胞悬液。

2. 组织培养设备：光照培养箱精准模拟自然光照周期（16 h 光照 / 8 h 黑暗），光照强度 2000 - 3000 lux，温度恒定 (25 ± 1)℃，湿度 60% - 70%，营造水稻愈伤组织及再生植株理想生长微环境；高压灭菌锅高效灭菌（121℃，20 min），确保培养基、器械无菌；超净工作台提供局部百级洁净操作区，滤除尘埃、微生物，降低污染风险。

（三）实验方法

1. 水稻愈伤组织诱导：精选饱满健康 “XX” 水稻种子，剥去颖壳，经 70% 乙醇表面消毒 1 min，无菌水冲洗 3 次后，投入 0.1% 溶液浸泡 15 min，期间轻柔振荡，强化消毒效果；再用无菌水反复冲洗 5 - 6 次，彻底去除残留消毒剂。将消毒种子接种至含 2 mg/L 2,4 - D 的 MS 固体培养基，暗培养 2 - 3 周，定期观察愈伤组织诱导状况，挑取色泽鲜黄、质地紧实、增殖旺盛的胚性愈伤组织，用于后续电注射转化。

2. 外源基因电注射：收集适量优质愈伤组织，置于含 0.4 M 甘露醇、5 mM 氯化钙的电注射缓冲液，用锋利手术刀精细切碎至 1 - 2 mm³ 小颗粒，轻柔吹散成单细胞或小细胞团悬液，血球计数板精准计数，调整细胞密度至 1 × 10⁶ 个 /mL。取 200 μL 细胞悬液与 10 μg 纯化 TsVP 基因及 hpt 基因混合质粒 DNA 轻柔混匀，迅速转移至预冷电穿孔杯；依前期预实验优化参数，设置电穿孔仪输出方波脉冲，电压 800 V，脉冲时长 30 ms，脉冲次数 2 次，电容 25 μF，电击瞬间观察悬液有无明显电穿孔现象（细微气泡生成），电击结束后室温静置 10 min，助细胞恢复稳态。

3. 转化愈伤组织筛选与植株再生：电注射处理后的愈伤组织用无菌滤纸吸干缓冲液，接种至含 50 mg/L 潮霉素、250 mg/L 头孢霉素的筛选培养基（MS + 2 mg/L 2,4 - D），暗培养 3 - 4 周，期间非转化愈伤组织因潮霉素抑制褐化死亡，抗性转化愈伤持续增殖；挑取存活、生长良好的抗性愈伤转至含 1 mg/L 6 - BA、0.5 mg/L NAA 及 30 mg/L 潮霉素的分化培养基，光照培养箱正常光照周期培养，诱导芽分化，待芽长至 2 - 3 cm 切下，转接至含 0.2 mg/L NAA、20 mg/L 潮霉素的生根培养基，促根系发育；全程严密监控培养物生长、污染情况，适时调整培养条件。

4. 转基因植株鉴定：提取抗性再生植株叶片基因组 DNA，采用 PCR（聚合酶链式反应）技术，以 TsVP 基因特异性引物扩增目标片段，电泳检测产物，初步判定外源基因整合；对 PCR 阳性植株行 Southern 杂交，精准确定基因拷贝数；利用实时荧光定量 PCR（qRT - PCR）剖析 TsVP 基因转录水平，结合 Western blot 检测 TsVP 蛋白表达量，综合评估外源基因在转录、翻译层面表达成效；对 T₁代转基因植株设不同盐浓度梯度胁迫处理，观测生长表型、生理指标，验证耐盐性状遗传稳定性与功能效果。

三、实验结果与分析

（一）愈伤组织电注射后抗性筛选结果

（二）转基因植株再生与表型特征

（三）分子鉴定结果

1. PCR 检测：对 19 株再生植株提取 DNA 行 PCR 扩增，14 株呈清晰特异性条带，与 TsVP 基因预期大小吻合，阳性率 73.68%，初步佐证外源基因成功整合入水稻基因组；未现条带植株或因基因整合失败，或整合位点不利扩增，需借助 Southern 杂交深入排查。

2. Southern 杂交：选 6 株 PCR 阳性植株杂交分析，结果显示 4 株含 1 - 2 个 TsVP 基因拷贝，整合位点稳定、无复杂重排，另 2 株多拷贝插入；单拷贝插入植株遗传稳定性、基因表达调控预期更优，后续功能验证聚焦此类植株，精准解析单拷贝基因功能传递规律。

3. qRT - PCR 与 Western blot：qRT - PCR 数据表明，4 株单拷贝插入转基因植株 TsVP 基因转录水平较野生型飙升 3 - 8 倍，差异显著；Western blot 同步检测到对应蛋白条带，且蛋白表达丰度与转录水平趋势契合，确凿证实 TsVP 基因在转基因水稻不仅整合成功，且高效转录、翻译，功能性蛋白正常表达积累，为后续耐盐功能发挥筑牢基础。

（四）转基因植株耐盐性检测

四、讨论

（一）电注射法优势剖析

（二）关键影响因素探究

（三）后续研究展望

五、结论