His标签蛋白纯化填料的选择和使用注意事项

来源：Cytiva（思拓凡）分类：操作使用

2024-08-22 10:00:31 234阅读次数

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His标签一般由6-10个连续组氨酸构成，最常用的为6×His（约0.84 kDa），其分子量小，对重组蛋白的折叠和功能影响小，一般纯化后不需要切除；

His标签的免疫原性低，成本低，可在变性条件下纯化，适用于多种表达系统，是目前使用频率很高的小标签；

His标签的位置可以根据蛋白结构、定位等特性放在蛋白的N-端或者C-端，也可以和其它的亲和标签串联使用。

组氨酸 (His) 侧链上的咪唑基团能够与多种金属离子（如Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等）形成配位键并选择性结合，利用这一性质，可以使用含有金属离子配基的填料来特异性纯化His标签蛋白。其中，Ni²⁺是纯化His标签蛋白的首选金属离子，也是目前使用最为广泛的金属离子，本文将重点介绍Ni²⁺在填料上的螯合方式和脱落原因，以帮助我们更好地选择产品和避免实验过程中出现的一些问题。

Ni²⁺的螯合方式

Ni²⁺共有6个配位键，填料上的螯合剂分别占用3-5个配位键，剩余的配位键用于捕获His标签蛋白，文献报道中常用的螯合剂及其相互作用方式如表1和图1所示：

表1：IDA vs. NTA vs. TED

图1：His标签与IDA、NTA、TED三种配位方式中的Ni²⁺相互作用的模式^[1]

填料的选择

已螯合金属离子的填料产品如下：

填料选择时，主要关注金属离子的类型和螯合方式、填料粒径、结合载量、耐压条件与运行流速等方面的参数，以及说明书中的化学耐受性。

TALON Superflow填料预螯合了Co²⁺，采用 “4+2” 配位形式，Co²⁺脱落率低。因为Co²⁺的离子半径较大，所以亲和力更低，能减少杂质的吸附，可以达到更高的纯度，但载量会相对低一些。

未螯合金属离子的填料产品如下：

常用的金属离子有Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Co²⁺，因螯合方式、亲和力等方面的差异，这些金属离子在对不同蛋白的纯化过程中会表现出不同的选择性。Ni²⁺最常用；Co²⁺和Zn²⁺结合弱，背景低、纯度高；Cu²⁺对许多His标签蛋白表现出较高的亲和力；Cu²⁺和Zn²⁺也常用作纯化非标签蛋白质^[2]。具体请参考微文：? 金属离子纯化的多彩世界。

如果需要考虑配基的脱落问题，可以优先选择IMAC，以Ni²⁺为例，使用IMAC Sepharose 6FF和Chelating Sepharose FF纯化His标签蛋白时，洗脱得到的蛋白中Ni²⁺的脱落情况是Chelating约为IMAC的6-7倍^[3]。

每种填料各有所长，请根据纯化目的进行选择。首选预螯合了金属离子的填料，当蛋白表达量较高，追求高载量时，可以选择Ni Sepharose 6FF或HP，两者主要是填料粒径上的差异，FF平均粒径90 μm，流速快、易放大，可以搭配 PD-10空柱（滤膜孔径约为20-85 μm）进行重力纯化；HP平均粒径34 μm，具有高分辨率，HP纯化后峰更窄，分离度更好，样品浓度高，节省了浓缩步骤的时间，但细粒径会带来更高的反压，所以HP的流速较慢，且搭配PD-10空柱使用有漏过的风险。真核细胞分泌表达的蛋白，首选Ni Sepharose excel。为了避免金属离子对蛋白的干扰，需要添加1 mM EDTA时，也首选excel。追求高纯度时，可以考虑TALON。IMAC和Chelating系列的填料，没有螯合金属离子，用户可以DIY，螯合需要的金属离子上去。

填料变色问题

还原剂导致填料变色

Ni Sepharose 6FF/HP/excel三款填料均能耐受5 mM DTT/DTE、5 mM TCEP和20 mM β-巯基乙醇，但实际操作过程中会发现在平衡缓冲液中添加DTT等还原剂可能导致Ni柱出现棕色，这是因为DTT等还原剂也是较强的螯合剂，通过其硫供体与金属离子形成稳定的络合物（如图2所示）。

图2：Ni (II) 与DTT配位形成络合物的平面图^[4]

Ni²⁺并不是以同一种状态均匀螯合在填料上，即便对于IMAC来说，也有极少量的Ni²⁺以不足4个配位键和填料结合，在加入DTT等还原剂时，Ni填料中结合弱的Ni²⁺（一配位或二配位）和少量残留的游离Ni²⁺会被还原生成棕色的沉淀。所以在使用还原剂之前，建议采用不含还原性试剂的空白运行来去除弱结合的Ni²⁺，空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）包括：

5倍柱体积的双蒸水洗柱；

5倍柱体积的平衡液洗柱；

5倍柱体积的洗脱液洗柱；

10倍柱体积的平衡液平衡。

实际操作过程中也可以直接使用含高浓度咪唑（例如500 mM）的缓冲液冲洗填料至少5倍柱体积，水洗后再平衡上样。另外，在填料平衡阶段也可以不加还原剂，上样、洗杂、洗脱过程中再添加。

TALON Superflow请避免使用DTT、DTE和TCEP，最高可以耐受10 mM β-巯基乙醇（慎用，使用前也建议做空白运行）。注意，转染试剂聚乙烯亚胺 (Polyethylenimine，PEI) 也具有还原性，会还原Co²⁺。

碱洗导致填料变色

Ni Sepharose 6FF/HP在高pH条件下易形成有颜色的氢氧化物沉淀，会堵塞预装柱，所以不建议直接用NaOH清洗，可以先用20 mM sodium phosphate，0.5 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4缓冲液脱镍，然后进行NaOH清洁和NiSO4再生。而Ni Sepharose excel能耐受100 mM EDTA和1 M NaOH，无需脱镍，可以直接使用NaOH清洗，再生步骤简单。

TALON Superflow上的Co²⁺螯合的比较牢固，需要0.2 M EDTA脱钴，脱落的Co²⁺会与氢氧根结合产生沉淀，所以再生过程不适合在碱性条件下操作，推荐使用0.2 M EDTA，pH 7.0脱钴，由于EDTA固体在pH 7.0条件下不能完全溶解，建议先配制成0.5 M EDTA，pH 8.0的母液，通过稀释和调pH得到0.2 M EDTA，pH 7.0的终溶液。

上样导致填料变色

Ni柱亲和纯化，通常是在中性偏弱碱的pH条件 (pH 7-8) 下上样，样品中添加低浓度的咪唑以减少杂蛋白的非特异性吸附，添加高盐（例如0.5 M NaCl）以屏蔽杂质和填料之间的离子型吸附，从而提高洗脱样品的纯度。当然，咪唑浓度和盐浓度可以根据预实验的结果进行适当调整。上样过程中，填料上的Ni²⁺由于结合了大量的蛋白被遮盖后会呈现白色，当样品被洗脱后填料颜色会恢复，这种因样品结合导致的填料变色是正常的。上样过程中也有些特殊情况导致填料颜色加深，呈现深蓝色或紫色等，这是因为金属离子呈现出来的颜色与其本身电子跃迁和螯合剂共用电子对有关，比如TALON Superflow遇到6 M盐酸胍时填料会由粉色变为紫色，这并不影响His标签蛋白结合，当盐酸胍去除以后，填料会恢复粉色。

样品色素导致填料变色

如果填料变色是样品中色素残留导致的，在CIP阶段可以根据填料的耐受情况，尝试使用高盐、NaOH、有机溶剂（如30%异丙醇）、变性剂（如6 M guanidine-HCl）或酸（如0.1 M acetic acid）处理。除了单一的清洗方式，也可以考虑使用混合试剂进行处理，例如6 M guanidine-HCl+0.1 M acetic acid (+1-2 M NaCl) ，具体请参考微文：? 浅谈蛋白生产中色素的控制和去除。

Ni²⁺脱落问题

常见的竞争性洗脱剂

样品结合后一般是通过提高咪唑浓度竞争性洗脱，有些情况下可以在pH＞4.5的范围内降低pH增强洗脱效果，当pH＜4.0时可能会导致金属离子脱落^[2]。竞争性洗脱剂还包括螯合剂EDTA/EGTA、柠檬酸、游离氨基酸（如精氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸等）、氨等，它们与固定金属离子间有较强的配位作用，容易引起金属离子剥离导致填料发白，所以IMAC亲和填料纯化过程中需尽量避免使用这些成分。无血清培养基中可能含有类似螯合剂以及多种氨基酸，上清分泌表达的蛋白需要利用脱盐柱或切向流过滤系统更换缓冲液后上Ni Sepharose 6FF/HP等填料，而Ni Sepharose excel能耐受培养基中的螯合剂等成分，收集的细胞上清经0.22 μm滤膜过滤后可以直接上样。如果培养基中含有更高浓度的螯合剂，超过了Ni Sepharose excel的耐受范围，建议样品置换缓冲液后再上样。

Ni柱对精氨酸的耐受性

His标签促溶效果有限，如果目标蛋白表达过程中形成了包涵体，用尿素、盐酸胍等变性剂溶解会破坏蛋白的结构，纯化后的蛋白复性难度较大，而用精氨酸溶解后的复性会更加容易一些。但高浓度精氨酸会干扰His标签蛋白与Ni柱的结合，有研究发现导致结合减弱的主要原因是精氨酸会与His-tag竞争结合IMAC亲和填料上偶联的金属离子，将Ni²⁺从柱上剥离，当精氨酸浓度低于200 mM时这种干扰会大大减弱，且精氨酸能抑制杂蛋白与Ni柱的非特异性结合，以提高洗脱样品的纯度^[5]。也有研究显示IMAC (Ni-NTA) 填料对精氨酸的耐受浓度是500 mM^[1]，加精氨酸主要是为了维持蛋白的可溶性，如果200 mM助溶效果不好，可以尝试增加到500 mM以内，但是会牺牲收率。为了降低Ni²⁺脱落的风险，使用高浓度精氨酸时，建议优先选择Ni Sepharose excel。

总结

本文主要介绍了His标签蛋白纯化填料上Ni²⁺的螯合方式、填料的选择及常见的填料变色、Ni²⁺脱落问题，希望能帮助大家避坑，更好地完成实验。更多问题，欢迎拨打智荟专线，400-810-9118，转2号线。

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1. His标签蛋白纯化原理及过程

2. 如何挑选合适的纯化产品

3. His标签纯化常见问题及避“坑”指南

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参考文献

[1]. Helena Block, Barbara Maertens, et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review [J]. Methods in Enzymology, Volume 463, 2009, Pages 439-473.

[2]. Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged proteins.

[3]. IMAC Sepharose 6 Fast Flow Regulatory Support File.

[4]. Artur Krezel, Wojciech Lesniak, et al. Coordination of heavy metals by dithiothreitol, a commonly used thiol group protectant [J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 84, 2001, 77-88.

[5]. Ryota Abe, Motonori Kudou, et al. Immobilized metal affinity chromatography in the presence of arginine [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 381, 2009, 306-310.

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