重链抗体的可变结构域 (VHH) 也被称为纳米抗体 (Nanobodies/Nbs) ，是来源于骆驼科动物重链抗体的单体抗原结合结构域。
Nbs具有分子尺寸小、靶向选择性高、高溶解性和高稳定性等显著特点，这些特点都极大促进了高质量的药物开发。同时Nbs很容易在各种表达系统中表达，例如大肠杆菌和酵母等。由于以上这些原因，Nbs成为了蛋白质工程、诊断和疾病治疗的首选抗体片段之一，截止到2023年FDA已经批准了两款基于Nbs的治疗方法。目前有许多正处于临床前和临床研究中的Nbs候选药物，涵盖了广泛的疾病类型，包括癌症、免疫系统疾病、传染病和神经退行性疾病。[1]
VHH特点：
分子尺寸小，分子量约15 kDa；
组织穿透力强，可以有效穿透血脑屏障 (blood-brain barrier) ；[2]
较高的稳定性和溶解度，热稳定性强；[3]
免疫原性较低；
半衰期短，易于代谢。[4]
MabSelect PrismA
Protein A亲和层析填料长期以来一直被用于纯化单克隆抗体 (mAbs) ，被各种规模的生物制药企业广泛应用。Protein A和抗体的结合主要发生在单抗的Fc区，位于CH2和CH3之间。与此同时，Protein A也可以结合抗体Fab区可变重链上的VH3序列。
所开发的多款现代Protein A填料，例如MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA等，具有高结合载量以及高耐碱性等特点。
图1：单克隆抗体上不同的结合位点以及现代Protein A填料选择
MabSelect PrismA纯化VHH
在Tricorn 5/50柱子中填充1 mL MabSelect PrismA填料，将150 mL含有0.2 g/L VHH的大肠杆菌粗提物（Load=30 g VHH/L填料）上样到1 mL MabSelect PrismA柱子，保留时间为6分钟。VHH样品在50 mM pH 3.5的醋酸钠溶液中洗脱获得，纯化结果如图2所示。[6]
图2：使用MabSelect PrismA捕获大肠杆菌表达的VHH
对本次纯化中Load和Eluate分别取样进行检测，经过MabSelect PrismA纯化所得的VHH样品和上柱前相比，宿主蛋白的去除率达到4.3 log，而配基脱落仅10 ppm（表1）。
表1：MabSelect PrismA纯化VHH的检测数据对比[6]
将纯化过的VHH样品分别上样到装有不同Protein A填料的1 mL HiTrap预装柱中，分别是HiTrap MabSelect（rprotein A配基）、HiTrap MabSelect SuRe、HiTrap MabSelect PrismA这三种，然后进行酸性pH值洗脱。能够从图3中看到，MabSelect和MabSelect PrismA表现出类似的层析行为，而MabSelect SuRe显示出和VHH仅有较弱的相互作用。
图3：VHH和 (A) MabSelect、(B) MabSelect SuRe、(C) MabSelect PrismA三种不同填料的层析结果[6]
进一步地对VH3序列的关键氨基酸进行点突变，并测试氨基酸点突变后的VHH与上述3种现代Protein A填料的相互作用强弱，表2中的数据表明：在少数特定情况下，MabSelect SuRe填料也可以与VH3区域发生相互作用，而MabSelect和MabSelect PrismA填料对VHH序列变化的敏感性较低，在多数情况下都能和VHH样品结合。
表2：MabSelect、MabSelect SuRe和MabSelect PrismA填料与点突变VHH的相互作用[6]
MabSelect VH3
2023年11月上市了MabSelect VH3亲和填料，MabSelect VH3采用经过重组改造的protein A配基，该配基只与包含VH3序列家族的重链可变区的人源抗体发生相互作用，VH3配基与传统的protein A配基相比，Fc区相互作用已被敲除，而VH3区相互作用得到增强。VH3序列家族是商业化生物制品中抗体最常见的VH类型。利用这一特性可有效分离双特异性抗体 (bsAb) 和抗体片段，例如抗原结合区片段 (Fab) 、单链可变片段 (scFv) 和重链可变区 (VHH) 。
对包含VH3序列家族的双特异性抗体以及抗体片段具有高结合载量；
在捕获双特异性抗体时，对于产品相关杂质具有良好的分辨率；
耐碱稳定性：使用0.5 M NaOH清洗时保持稳定，可大大降低生物负荷的风险并具有较长的填料使用寿命；
与Fab VH3区域的单一相互作用，比具有双重相互作用（Fab及Fc区）的亲和配基更为有利，因为这种单一作用可更高效地将不需要的错配抗体和片段从目标bsAb中分离；
使用专为MabSelect VH3填料设计的VH3 Ligand ELISA试剂盒（货号29737000）可轻松测量配基脱落。
经过测试，针对VHH样品MabSelect VH3填料的动态结合载量略高于MabSelect PrismA填料大约11%–14%。如图4所示，MabSelect VH3填料与VHH的动态结合载量为36-39 g/L，同时MabSelect VH3填料和VHH的动态结合载量不太受保留时间长短的影响。[7]尤其是在较短的保留时间下，填料和VHH的高结合载量为生物制药提供了强劲的生产优势。
图4：不同保留时间下MabSelect VH3和MabSelect PrismA填料和VHH的动态结合载量对比[7]
高动态结合载量不仅在填料寿命的开始阶段非常重要，同时填料也需要能够承受严苛的清洁再生条件以降低生物污染事件发生的风险，为了实现填料的高利用率，动态结合载量必须在填料整个寿命周期内保持稳定。
将MabSelect VH3填料的初始动态结合载量设定为100%（即第0个周期，填料未使用NaOH处理时），之后每16个CIP循环后用经过纯化的曲妥珠单抗以及VHH样品分别测量填料的动态结合载量。测试结果表明：经过96次循环的0.5M NaOH清洁再生后，MabSelect VH3填料对曲妥珠单抗和VHH的相对剩余结合载量均高达93%（图5）。值得一提的是，在经过多达200次CIP循环后，MabSelect VH3填料对于曲妥珠单抗的相对剩余结合载量仍然有84%。[7]
图5：CIP条件为0.5 M NaOH接触时间15分钟，经过96次CIP循环后MabSelect VH3填料对mAb和VHH的相对剩余结合载量高达93%[7]
小编小结
VHH即纳米抗体由于其分子量小、组织穿透力强、稳定性强、免疫原性低等诸多特点，作为抗体药物的潜力赛道吸引了广泛的关注，在疾病诊断及治疗方面具有广阔的应用前景。所开发的现代Protein A填料MabSelect PrismA以及MabSelect VH3在VHH纯化上均有不俗表现，同时具备了高结合载量以及耐碱稳定性。
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