“未/难培养”的魔咒：从免培养识别到原位分选，难培养微生物还能这样做！

在自然环境中，绝大多数微生物难以通过常规培养方法成功分离。无论是环境功能菌群，还是深海、肠道等复杂或极端生态位中的微生物，“未培养”或“难培养”状态始终是制约功能解析与应用转化的核心瓶颈。传统研究路径依赖“培养—筛选—测序”，但在实际应用中往往面临两方面限制：一是许多关键功能微生物在脱离原生环境后迅速丧失活性，甚至无法存活；二是真正承担特定代谢功能的细胞通常丰度极低，群体平均方法难以准确捕获其真实贡献。因此，在不依赖培养的前提下，于原位状态直接识别、定位并解析功能微生物，成为当前研究的重要需求。

 近年来，拉曼光谱、稳定同位素标记（如 D₂O、13C）与可视化单细胞分选技术的发展，使研究者能够在复杂体系中直接获取单细胞层面的代谢表型，并基于表型判据进行精准分离，为未/难培养微生物的原位研究提供了可行的技术路径。围绕这一研究范式，长光辰英构建了以PRECI SCS-R300 拉曼单细胞分选仪与 Scatcher Ultra 单细拉曼光镊操纵与分选仪为核心的平台方案，系统性支持未培养/难培养微生物的原位识别、分选与后续解析。

在活性污泥体系中，真正承担 BPA降解功能的细菌通常丰度极低，且难以通过传统平板分离获得。研究中引入 13C-BPA 稳定同位素标记，结合单细胞拉曼光谱，在不破坏原生体系的条件下直接识别摄取并代谢 BPA 的活性细胞。

随后，通过 PRECI SCS-R300 可视化拉曼分选，将这些“原位标记”的单细胞精准分离，用于后续基因组与功能分析，从而实现对 BPA 降解菌的免培养原位捕获。

图1：双酚A降解菌的拉曼原位识别与分选捕获流程示意图^[1]

02 土壤原生解磷菌的原位活性检测

土壤中解磷菌（PSB）在农业养分循环中具有重要意义，但其活性状态高度依赖微环境，离体培养往往难以真实反映其功能。

通过 D₂O 重水标记，研究者可在土壤原生体系中直接标记代谢活跃的解磷细胞，并利用拉曼光谱对单细胞层面的代谢活性进行判定。结合可视化单细胞分选技术，实现对原生土壤环境中真实活性 PSB 的定向获取，为功能菌研究提供更加可靠的原位证据。

图2：重水拉曼标记筛选土壤活性解磷菌流程图^[2]

03 功能微生物的定向培养新策略

针对未知培养条件的功能微生物，研究者提出了“先识别，再培养”的反向思路。通过拉曼-13C同位素技术在复杂体系中筛选具备特定代谢特征的单细胞，并利用 PRECI SCS-R300 （或 Scatcher Ultra 拉曼光镊系统）完成精准分离，随后结合单细胞基因组信息反向设计培养条件，实现对难培养功能菌的精准筛选与培养突破。

图3 单细胞拉曼分选-稳定同位素示踪-反向基因组学（RACS-SIP-GDC） 技术路径示意图^[3]

04 深海微生物的免培养原位检测

深海环境样品极其珍贵，且微生物往往无法耐受常规实验操作。

利用 Scatcher Ultra 单细胞拉曼光镊操纵与分选仪，实现液体原位固定与单细胞拉曼检测。研究者可在不依赖培养的情况下，直接对深海微生物的代谢特征进行分析，光镊操纵技术对目标细胞的温和操控与分离，为深海微生物的功能研究提供了一条低扰动、免培养的原位研究路径。

图4. 光镊拉曼结合深度学习的深海微生物原位识别结果^[4]

05 肠道微生物的原位解析与厌氧单细胞培养

肠道微生物群中大量关键成员属于严格厌氧、难培养类群。通过多模态成像、拉曼表型识别与可视化单细胞分选，研究者可在保持细胞活性的前提下，对目标肠道微生物进行精准定位与分离；进一步结合微阵列与厌氧培养体系，实现从原位识别 → 单细胞分选 → 活体培养 → 测序验证的闭环研究流程。

图5 荧光探针标记肠道微生物分选扩增测序(FLCiSS)流程图^[5]

^{图6 厌氧菌单细胞分选培养与扩增和测序验证}