CAR检测通用型新方案：抗G4S Linker和Whitlow/218 Linker流式兔单抗来助你！

CAR-T这一创新性免疫疗法正不断在癌症、自身免疫性疾病、感染、纤维化等领域取得突破性研究。然而，在CAR-T研发过程中，一个长期存在棘手难题始终困扰着科研人员：为确定CAR阳性率，需要针对不同的靶点开发新的检测试剂。这些迭代开发的试剂还需要独特的验证过程，不仅成本高昂、费时费力，更可能因抗体特异性不足带来数据偏差，影响项目进度。

面对这一挑战，CAR-T开发亟需一套“通用型”检测方案。基于此，义翘神州推出了特异性结合scFv片段重链和轻链间Linker的兔单克隆抗体，能够特异性识别G4S Linker或Whitlow/218 Linker。兔单抗具有多靶点通用的特点，经验证其具有高亲和力和高特异性。义翘神州已成功开发FITC、PE、APC等标记的流式抗体，为CAR分子的表征与功能检测提供通用型解决方案。

柔性Linker：非信号域却至关重要

要理解这一检测方案的原理，首先需要认识CAR分子的基本结构。CAR分子融合了抗体的抗原识别能力和TCR信号转导特性，不依赖TCR-MHC调控T细胞功能。CAR分子主要包括四个核心部分：胞外抗原识别结构域、铰链区域、跨膜结构域及胞内信号转导域。其中抗原识别结构域主要由单链可变片段（scFv）构成，其亲和力、免疫原性、特异性和结构是影响CAR-T细胞疗效的关键因素。

在CAR分子结构中，连接肽（Linker）是将scFv中重链（VH）与轻链（VL）共价连接的人工合成肽，目前常用的柔性Linker包括G4S Linker与Whitlow/218 Linker，由不同的多肽组成。尽管序列短，但Linker在保持抗体构象稳定、增强亲和力、避免空间位阻等方面发挥着关键作用。

具体来说，G4S linker是一种常用的氨基酸连接肽，由甘氨酸（G）和丝氨酸（S）组成。该基序包含四个甘氨酸残基和一个丝氨酸残基，重复3次或4次形成15个氨基酸的（G4S）₃或20个氨基酸的（G4S）₄。这类氨基酸残基本身的小分子特性为连接肽赋予了结构柔性，而丝氨酸的极性则能提升连接肽的溶解度，从而减少对可变区折叠及抗原靶点结合的干扰。另一种被广泛应用的是218连接肽，也常被称作Whitlow连接肽，其氨基酸序列为GSTSGSGKPGSGEGSTKG。Whitlow/218经人工设计，自身发生聚集和水解的可能性降低。由于G4S和Whitlow/218 Linker的长度相近，目前尚不清楚二者的选择是否会对CAR-T细胞的功能产生显著影响。

CAR检测：免疫治疗评估与质量控制的核心

了解了Linker的重要性后，我们再来看看CAR检测在开发过程中的关键作用。CAR阳性率，即CAR-T细胞中CAR的表达水平，是评估产品活性的关键数据。只有达到一定的阳性率，CAR-T细胞才能有效识别并杀伤肿瘤细胞。在完成细胞输注后，还需通过检测体内CAR表达情况，监测CAR-T细胞的扩增和持久性，进而判断治疗效果和预测疗效持续时间。

CAR检测贯穿CAR-T细胞产品的整个开发周期，包括早期研发阶段CAR的表达确认、CMC质控阶段CAR细胞阳性率质控等。同时，动态检测CAR-T细胞表达变化，可评估其潜在免疫原性及安全风险。

此外，CAR检测还可用于监测CAR-T细胞的药代动力学（PK）过程，评估其在体内的分布、代谢和排泄情况。这为评估治疗反应和相关副作用提供了有价值的信息，有助于优化CAR-T细胞疗法的剂量和给药方案。

然而，现有检测方法有一定的局限性。比如结合到免疫球蛋白κ轻链的Protein L，无法检测含有λ链的CAR。针对抗体Fc段的多克隆抗体可能与患者自身IgG发生交叉反应，导致假阳性。抗独特型抗体虽具有高度特异性和敏感性、背景染色低，但难以获得。目前主流的重组靶点蛋白流式检测法虽精确性和特异性高，但仅限于检测单一特定靶点，不适合CAR-T筛选及临床前研究。因此，建立一套灵敏、可靠、通用的CAR表达检测系统，对CAR-T细胞疗法的开发和评价至关重要。

通用型解决方案“问世”

在开发通用型CAR检测方法的过程中，抗连接肽（linker）单抗带来了“希望之光”。大多数CAR包含单链可变片段（scFv）（Carvykti除外，具有独特的纳米抗体结构VHH）。scFv带有柔性Whitlow 218或G4S连接肽。这些标准化的氨基酸序列为检测提供了明确靶标。无论CAR-T识别的肿瘤抗原是CD19、BCMA、Claudin18.2还是CD22，只有其结构中含有连接肽，抗连接肽抗体均能准确检测。与依赖scFv抗原特异性检测方法相比，抗连接肽抗体显著提升检测的通用性和一致性。

Kimble EL等人开发的抗Whitlow Linker抗体技术路线

（源自文献：doi:10.1136/jitc-2025-013123）

抗Linker 抗体：高效CAR检测利器

义翘神州正式推出全新的抗Linker兔单抗，能够特异性结合scFv片段重链和轻链之间的G4S linker或Whitlow/218 Linker序列。该方案不区分CAR-T靶点，实现不同靶点多种CAR分子的通用检测，兼具兔单抗的高亲和力与高特异性。目前已开发FITC、PE、APC等多种标记的流式抗体。

义翘神州抗G4S或Whitlow/218 Linker兔单抗具有以下5大核心优势：

全场景通用

不管CAR靶向何种抗原，只要含有G4S或Whitlow/218 Linker序列，就可用该类抗体进行检测，告别“一CAR一试剂”的定制化困境。

多标记选择

已上线FITC、PE、APC、AF488、AF647、Biotin等标记的流式抗体，满足多场景需求。

特异性高

自研开发的兔单克隆抗体，流式检测PBMC非特异结合低于0.5%。

体内体外通用

既可用于体外转染效率评估，也可在体内动态追踪CAR-T细胞扩增效果与持久性。

研发提速

省去定制化检测试剂的开发与验证步骤，缩短CAR设计与表达验证周期，加快项目推进。

Note新品上市！

Recombinant Anti-G4S Linker Antibody (PE), Rabbit Monoclonal （产品货号: 111303-R0017-P）

高效识别CAR阳性细胞

Flow cytometric analysis of anti-CD3E CAR expression on anti-CD3E CAR-transfected 293FT cells. Cells were stained with PE-conjugated anti-G4S linker Antibody. The fluorescence histograms were derived from gated events with the forward and side light-scatter characteristics of intact cells. Non-transduced 293FT cells were used as a control (right).

高特异性结合

Binding activity of PE-conjugated anti-G4S linker Antibody to PBMC cells. PBMC cells were stained with FITC conjugated anti-CD3 antibody and PE-conjugated anti-G4S linker Antibody and detected by flow cytometry. PE signal was used to evaluate the non-specific binding activity to PBMCs.

小结与展望

综上所述，抗Linker兔单抗贯穿CAR-T研发全流程：在临床前快速评估CAR阳性率，在CMC质控中提供稳定、可重复数据，在临床前动物模型中动态监测CAR-T细胞的体内扩增与持久性。该通用型方案与现有靶点特异性方法形成有效互补，显著提高研发效率与数据质量。

除此之外，义翘神州还提供CAR-T细胞疗法综合解决方案，涵盖CAR开发、T细胞激活、慢病毒包装、CAR-T细胞扩增与质量控制，全面支持从早期研发到临床前研究的各个环节。

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本文不属于治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。

【参考文献】

1.Kimble EL, et al. Novel antibodies for identification, selection, and manipulation of T cells expressing Whitlow linker-containing CARs. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2025. doi:10.1136/jitc-2025-013123

2.Katharina Schindler, et al. Linker-specific monoclonal antibodies present a simple and reliable detection method for scFv-based CAR NK cells. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 2024, https://doi.org/10.1016/j.omtm.2024.101328

3.Grahnert, A et al. Evaluation of Anti-CAR Linker mAbs for CAR T Monitoring after BiTEs/bsAbs and CAR T-Cell Pretreatment. Biomedicines 2024, https://doi.org/10.3390/biomedicines12081641

4. Zhiwei Wang, et al. CAR-T therapy dilemma and innovative design strategies for next generation. Cell Death and Disease, 2025.https://doi.org/10.1038/s41419-025-07454-x