智荟锦囊之脱盐柱你用对了吗？

智荟专线

#智荟锦囊

第二期主题：脱盐柱

缓冲液置换的原理是凝胶过滤层析的组分分离 (Group Separation) ：超过填料排阻极限的生物大分子，因为无法进入填料孔隙中，而排阻在外，紧跟着外水体积（30%柱体积）Z先出峰；而小分子则依据其分子量大小，会不同程度的进入填料孔隙中，晚出峰，从而将大分子和小分子杂质分开。常用于样品准备、层析步骤之间的衔接、去除染料或小分子标记物、终止反应、去除核苷酸以及脂质体包封率的检测^[1/2]等。脱盐本身即是一种缓冲液置换，将样品从高盐缓冲液置换到低盐或无盐缓冲液。

Sephadex G系列填料，为葡聚糖交联还原氯丙烷（即异表氯醇）。目前Sephadex系列产品主要用于组分分离，如缓冲液置换。Sephadex G系列填料的不同数字（G-10、G-15、G-25、G-50、G-75和G-100），代表其使用不同分子量范围的葡聚糖，G后面数字越小，葡聚糖共聚物的交联度越高，分离样品的分子量范围越小。另外，随着交联度的增加，填料的溶胀降低。 

G系列填料对于球蛋白、多糖和DNA样品的分离范围请参考表1和表2。其中，G-25Z为常用，适合目的样品分子量大于5 KD^[4]。缓冲液置换要求目的样品的分子量大于排阻极限（可以参考分离范围的上限），也就是无法进入填料孔隙中，同时，杂质小分子Z好低于分离范围的下限，在接近1个柱体积位置出峰，对于G-10和G-15建议Z好小于100 Da。

根据样品分子量、体积和操作方式，选择合适的脱盐柱产品。

HiTrap系列 (5 mL) ，可以注射器、蠕动泵或?KTA仪器操作，Z多5根串联。更大体积连接?KTA仪器使用的HiPrep系列 (15 mL) ，Z多4根串联。

例如HiTrap串联后，上样量随着柱体积而增加，反压增加需适当降低流速，但是分辨率也稍好^[6]：    

当需要处理更大体积样品时，也可以购买散装填料自行装填空柱。粗颗粒 (Coarse) 反压低、流速较快，细颗粒 (Fine) 流速较慢但分辨率较高。一般，选择装填高度较矮 (10~30 cm) 且直径大的柱子^[4]，以提高流速缩短运行时间。

G系列填料装填方法请参考产品操作说明^[12/13]，溶胀后粒径大小如下，可以用于评估柱效：

不同形式的预装脱盐柱和填料的对应关系如下：

PD-10脱盐柱（货号17085101）预先装填了8.3 mL的Sephadex G-25 M填料，顶端和底端各有一片烧熔的聚乙烯多孔滤板（孔径20-85 μm），确保填料在重力流的作用下不至于流干。PD-10空柱体积为13.5 mL，可以购买LabMate PD-10 Buffer Reservoir储液槽将空柱的体积增加25 mL，使得平衡、wash等在一步内完成（无需反复多次补充缓冲液）。 

手动脱盐的效果：通常，PD系列手动脱盐柱的脱盐效率在85~90%以上，样品回收率在70%~95%以上（依据样品性质而定）^[6]。

作为一种分子筛，脱盐应用中的Z关键的影响因素是样品体积（而非样品量）。例如，PD-10柱床体积是8.3 mL，推荐Z大上样体积8.3 mL*30%（外水体积）≈2.5 mL，重力操作的典型出峰情况如图4^[8]。平衡柱子后，上2.5 mL样品（注意这个时候流出的是之前的平衡缓冲液，无需收集），之后加3.5 mL buffer赶出目的样品，即在2.5~6 mL进行收集，洗脱体积一共为3.5 mL。

HiTrap Desalting 5 mL，推荐上样体积1.5 mL。超过该范围继续增加上样体积，峰展宽和面积增加，蛋白峰和盐峰之间的交叉变多，分辨率降低^[4]。根据收集样品体积的不同，将损失样品回收率或纯度。

为了确保脱盐效率，可以降低上样体积至15-20%柱体积^[4]，但手动操作时可能需要补足体积而造成样品被进一步稀释，此时也可以考虑多次重复过柱脱盐。

一般，样品浓度对于脱盐无显著影响。样品浓度和流动相之间的粘度系数 (Viscosity) 在1.5倍以内即可，对于常规的水溶性缓冲液，基本对应于蛋白浓度在70 mg/mL^[4]以下，但通常建议蛋白浓度低于30 mg/mL；高分子量聚合物如多糖建议浓度在5 mg/mL以内^[4]；DNA样品在1 mg/mL以内^[9]。另外，注意样品充分溶解且稳定、无聚集沉淀、不过于粘稠而造成峰形拖尾。上样前注意用0.45 μm或0.22 μm滤膜过滤或离心（15,000×g, 15 min）去除颗粒^[4]。

脱盐柱对于部分复杂样品同样适用，如HiPrep 26/10 Desalting用于10 mL小鼠血浆（10,000 g离心10 min后）样品^[4]以及毕赤酵母表达重组蛋白的发酵上清（0.45 um滤膜过滤）^[6]。

Sephadex填料的强度和pH稳定性，根据其交联程度而有差异。以Sephadex G-25为例^[6]，在常用的缓冲液中稳定，如8 M尿素、6 M盐酸胍以及离子和非离子型去污剂。低浓度的醇类（如甲醇、乙醇、异丙醇）可以用于缓冲液或样品中，推荐浓度低于25 v/v%。避免超过推荐pH范围或使用氧化剂。操作条件下pH稳定区间在2~13。测试中，暴露于0.1 M HCl中1~2小时或0.02 M HCl中6个月，不影响填料性能。甚至可以储存于0.01 M NaOH中（功能改变需自行测试）^[11]。案例中，PD-10脱盐柱可以去除蛋白样品中的DTT或碘乙酰胺。对于尿素的去除，建议逐步降低缓冲液中尿素的浓度并设置梯度进行多次换液，避免蛋白变性沉淀。 

PD-10脱盐柱等手动脱盐产品，均设计为一次性使用，理论上不建议重复操作。但是，当多次操作之间的交叉污染不是关注点时，可以少次重复使用。仍然建议用于同一种样品，并检测实验重复性。可以参考HiPrep 26/10 Desalting的清洁操作^[4]如下：

优先推荐碱洗，注意交联度更低的G-50~G-100在进行碱洗时，请将填料移出柱管，避免填料体积膨胀。Sephadex G-25使用0.2 M NaOH进行60~90 min的清洁和消毒，之后使用水或缓冲液冲洗，可以耐受上百次循环处理^[6]。另外，Sephadex可以在120度 (pH 7.0) 高压湿热灭菌^[12/6]。 

Sephadex  G-25干粉填料，建议储存在4~30度。装柱前参考表1量取填料（建议按照Z小溶胀体积计算，量取尽可能多的填料）并溶胀后使用，或者直接购买预装柱，保存前水洗，储存在20%乙醇或10 mM NaOH^[11]中，4~30度，不要冷冻。 

DNA样品的脱盐推荐illustra系列产品，如NAP-5/10/25。NAP柱子中的填料是Sephadex G-25 Superfine, DNA grade（即DNase free），经过测试，保证重复性和DNA样品的高回收率，基本无非特异性吸附。可以排阻~10 bp以上的DNA片段。更小体积 (25–100 μl) 的核酸脱盐，可以尝试illustra MicroSpin S-200, S-300 and S-400 HR产品。   

B站视频：如何使用离心法对PD系列脱盐柱进行操作

参考文献