层析纯化小课堂 | 装柱那点事儿

上一期小课堂，我们已经学习了如何选择合适的空柱，那么接下来就是激动人心的装柱环节了。

那位拧开柱管，抓起填料瓶就要倒的同学，先别着急，装填层析柱，没那么简单。填料装填的均匀与否，影响着层析柱的柱效和分离效果。这可是一项耗时耗力的精细活儿，只有掌握正确的装填技术，并且充分练习，才能事半功倍，装出满意的层析柱。

古语有云“谋定而后动”，装填柱子，第一步是从设计层析柱的装填高度，计算所需要的匀浆用量开始的。大家购买到的散装填料往往是填料和保存液的混合物，而我们装柱所需要的填料匀浆则是装柱缓冲液和填料的混合体系，所以需要准确量取所需填料体积的填料并配置匀浆。尤其是对于Tricorn柱这种柱高调节没有那么灵活的柱管，填料量准确才能避免“装不够”和“装不下”问题的发生。所需量取的填料的体积的计算方法如下：

柱管内径和最高可容纳的柱床高度可从空柱说明书中查到，压缩因子可查阅填料说明书和装柱指南。

计算出装柱所需的填料体积后，我们就可以用量筒量取填料了。先轻柔地摇晃填料瓶，将瓶中的填料用保存液重悬起来，再倒入量筒中测定体积。填料沉降需要一定时间，需要耐心等待，待体积稳定后，再读数。之后将填料配置成装柱匀浆，此时需要将保存液置换成装柱缓冲液，可使用抽滤换液或是静置倾倒上清液的方法进行置换。装柱缓冲液的成分可参考填料说明书或装柱指南，常见缓冲液是氯化钠溶液或氯化钠-乙醇-水溶液，这是由于低浓度的氯化钠可以防止填料在沉降过程中挂壁。装柱匀浆的浓度会根据柱管的内径和填料的粒径有所区别，大致为40-60%，具体浓度亦可参考填料说明书或装柱指南。

可别小看拼装层析柱这一步骤，任何一个部件没有拧紧都可能会导致后续装柱过程中漏液，从头来过。关于层析柱的拼装，可参考以下拆装视频：

组装完成后需要将装柱器和空柱完整的接入层析系统中，给予工作流速，在有压力的情况下，检查各接口处是否渗漏。需要注意的是，使用过的空柱管一定要充分清洗后再重新组装，避免填料残留在密封圈上导致漏液。而清洗后的层析柱各部件应在擦干的状态下进行组装，水滴可能会导致密封圈过滑造成内管滑动。

待检查密闭性没有问题后，倒出柱管内的液体，垂直固定柱管，用玻璃棒引流，倒入填料匀浆，匀浆最好一次性倒入柱管中。将液体加满至管口，拧紧上端口，将柱子连入?KTA系统，下端开放连通大气，在有流速的条件下填料沉降，柱床压实。压实分为两个阶段，第一阶段恒定流速，第二阶段恒定压力。恒定流速阶段，此时装柱器连接在柱子上，柱管下端与大气连接，随着填料沉降，可观察到压力逐渐升高。恒定压力阶段，拆去装柱器，将柱子下端接入KTA系统中，设定压力后，可观察到随柱床压实，流速逐渐减慢至不再改变。

待流速稳定，柱床不再继续下降后，用马克笔标注柱床位置。对于XK柱和HiScale柱，然后将柱头调节杆旋转至标记线下1-2 mm的位置，拧紧其调节杆上端黑色部件，使密封圈充分膨胀。对于Tricorn柱，将填料上端滤膜放入柱管中，拧紧柱头至调节杆压实滤膜和柱床，压下柱头上方锁扣。至此层析柱装填的操作就全部完成了。

装填完成后，需要通过柱效测定评价层析柱的装填效果，柱效测定的方法有两种，一种是使用丙酮作为样品，水作为流动相，测定紫外吸收峰，另一种是用0.8 M NaCl作为样品，0.4 M NaCl作为流动相，测定电导峰值。

运行完成后，对色谱曲线进行积分，计算理论塔板高度 (HETP) 与不对称因子 (As) 。HETP＜5 dp（填料直径），不对称因子在0.8-1.5中间，说明柱子装填效果较好，可以开始使用了。

“纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行”想要装填一根合格的层析柱，空有理论是不够的，需要不断地练习，关注每一个操作细节，希望在这期小课堂的帮助下，屏幕前的你也能够装出满意的柱子。

叮叮叮，休息时间到，喊你看直播了！

膜蛋白纯化遇到问题？研究思路卡住了？不知道如何选择合适的产品？

扫描下方二维码，预约直播，大咖分享带你了解前沿研究，实验室实景演示带你学习实验中各种容易被忽略的细节。快动动手指，轻松搞定膜蛋白纯化，8.28直播间等你来。

 点亮

与

，传递信息 ↓ ↓