明察秋毫：EAD结合MS-DIAL 5实现高通量脂质精细结构注释

脂质作为生命基本物质，参与很多生物途径，其分子结构上具备普遍的同分异构现象，并且不同种异构体在体内可能扮演者天差地别的生理功能，因此准确定性出脂质精细结构十分重要。传统的CID（碰撞诱导解离）碎裂技术无法提供有效的碎片信息，比如甘油或是鞘氨醇骨架、酰基位点、特别是酰基脂肪酸双键位点等。SCIEX推出的ZenoTOF? 系列高分辨质谱系统具有EAD（electron-activated dissociation，电子活化解离）碎裂功能，可以完美的解决以上难题。该技术大大拓展了脂质精细结构表征，获得脂质精细结构解析的所需信息，实现Sn1、Sn2异构、酰基脂肪链C=C双键位点和双键位点的顺反异构等脂质精细结构的注释。

大多数软件对于脂质的结构注释是基于脂质标准品在CID单碎裂模式下的数据衍生而来，因此在处理不同碎裂模式（比如CID和EAD）质谱数据的时候，往往不能给出准确的结果；这极大的限制了脂质组学数据鉴定的准确度和处理通量。基于该原因，本文献报道了最新一代的MS-DIAL 5软件，可以实现不同碎裂模式下脂质质谱数据的注释，推动了高通量且准确地脂质组数据注释的进步。

表1. 不同脂质组处理软件功能比较

SCIEX ZenoTOF 7600质谱含有Zeno Trap技术可富集碎片离子并极大的提高二级碎片的信号强度；其独特的EAD裂解技术可以获得更丰富的二级碎片信息可提高库匹配定性分析结果准确性。作者利用IDA（数据依赖性采集）采集方式结合DBS功能（动态背景扣除）、Zeno Trap和EAD技术，可在一针进样过程中实现了全面的脂质高质量的二级谱图采集，以实现深度的脂质成分分析。

作者选择了 716种小分子化合物的MS/MS图谱来评估 EAD-MS/MS 的信息含量，基于光谱熵值，结果显示KE能量为 15 eV 时能产生最多的 MS/MS 信息（图 1a）。随后，使用8到20eV的KE分别采集了65种脂质的MS/MS图谱，结果表明，在14eV的KE下，产物离子的峰强度显著高于10eV下的（图 1b）；又相对于18eV，该能量不同脂质中均可以提供了稳定和独特的诊断离子，用于表征脂质碳碳双键位置（图1 b-d），因此选择了14 eV作为脂质结构分析的最佳KE值。进一步的，通过详细分析MS/MS光谱，作者解释了H损失碎片（蓝色峰）和自由基碎片（黑色峰）丰度增加的机理（图 1b）和delta-6和9碳位置观察到的H增益碎片（红色峰）丰度增加的机理（图 1d）。

基于该能量下图谱碎裂离子种类和相对强度的性质，开发了一种决策树算法，以阐明脂质结构，运用在MS-DIAL 5中。该算法首先对脂质的分子物种水平进行了注释，如PC 16:0_20:4和神经酰胺（Cer）18:1;O2/16:0。sn-、OH-和C=C位置被独立评估。对于sn-和OH位置的评估，候选物根据诊断性产物离子的丰度进行排序，如果它们与理论m/z值不符，则不进行位置匹配。对于脂质中的C=C位置的评估，参考了包括H损失、自由基和H增益离子相对丰度等信息，基于实验和计算生成的虚拟谱图之间关于酰基链的相关性的局部相关系数进行排序的，给出推荐结果。

因此，作者设计了一个EAD注释程序，从已充分表征的脂质中对候选物进行排名，而不是发现新的结构。这使得可以全面注释27个亚类，包括15个鞘脂亚类（GP）、5个鞘脂亚类（SP）和7个甘油酯亚类（GL）。

图2. 使用MS-DIAL 5进行深入脂质注释的动态范围评估。a 确认诊断离子存在所需的动态范围和检测限（LOD）； b 注释级别术语与脂质描述之间的关系。c 基于EAD-MS/MS图谱质量验证MS-DIAL 5环境对脂质结构描述的有效性。

作者使用1,2-二去氧戊糖基-甲基甘油磷脂（DLPC）和1-棕榈酰-2-花生四烯酸酰-乙基甘油磷脂（PAPC）来该流程完全鉴定需要的物质浓度。结果表明，需要较高浓度脂质进入LC-MS系统才可以确定的sn-和C=C位置（PC为500–1000fmol）（图2a）。接着使用两种脂质混合标准品，评估并该算法在不同浓度下的准确度。结果表明（图2b、c），在高浓度的PC、Cer和鞘磷脂（SM）中，甘油磷脂（GP）的sn-和C=C位置以及鞘脂（SP）的OH-和C=C位置都得到了实现。

然而，确定其他GP脂质亚类的sn位置证明具有挑战性，引入金属离子（如钠）有助于获得更简单的结构以阐明图谱，于是作者在本研究中提供了一个用于钠加合物形式的EAD注释方法，基于此该程序通过这种基于决策树的诊断方法在注释过程中达到了96.4%的准确率。

图3. PC 16:0/18:1脂质异构体混合图谱的MS-DIAL注释。a 在共洗脱峰PC 16:0/18:1(9)和PC 16:0/18:1(11)的混合光谱中验证MS-DIAL 5环境进行脂质注释。PC 16:0/18:1(9)和PC 16:0/18:1(11)的H损失碎片离子的“C=C高”峰值分别用蓝色和红色标记。这些分子片段离子的“C=C高”峰值分别用天蓝色和橙色标记。b 在共洗脱峰PC 16:0/18:1(9)和PC 18:1(9)/16:0的混合光谱中验证MS-DIAL 5环境进行脂质注释。PC 16:0/18:1(9)和PC 18:1(9)/16:0的nt-特异性离子分别用蓝色和粉色标记。c 在小鼠大脑和SRM 1950 NIST人血浆脂质提取物中验证MS-DIAL 5环境进行脂质注释。颜色定义与图3a和图3b相同。d 在不同浓度的PC 16:0/18:1(8)添加的小鼠大脑脂质提取物中验证MS-DIAL 5环境进行脂质注释。‘X’符号表示MS-DIAL注释未匹配任何PC 16:0/18:1(9)，PC 16:0/18:1(11)，PC 18:1(9)/16:0和PC 18:1(11)/16:0。

细胞含有具有不同双键位置或sn1/sn2排列的多种异构脂质，这些脂质有时难以通过色谱法分离，因此在常规的CID模式下并不能将其分别鉴定。因此，作者使用PC 16:0/18:1(9Z)，PC 18:1(9Z)/16:0和PC 16:0/18:1(11Z)的异构混合物来评估代谢物共洗脱对脂质结构注释的影响，因为这些异构体存在于许多生物样本中（图3），在LC实验条件下无法通过色谱区分，导致分析挑战。结果显示，MS-DIAL 5可以正确地将高浓度的脂质异构体作为首选的候选脂质（图 3a, b）。

于是作者使用 LC-EAD-MS/MS和MS-DIAL 5系统来表征小鼠大脑和NIST SRM 1950血浆中的PC 16:0_18:1异构体。结果显示，MS-DIAL 5程序在小鼠大脑和人血浆中将PC 16:0/18:1(9)认定为最可能的脂质异构体（图 3c），这与先前的研究一致，但是其同分异构体并未做标记，这是与实际情况不符的。

于是作者在MS-DIAL 5中添加了一个功能，可以显示其他可能的峰值注释，这可能会揭示共洗脱的异构体脂质。于是，在大脑中，PC 18:1(9)/16:0 被注释为第二潜在候选者（图 3d），具有高置信分数。因此，MS-DIAL 5正确识别了预期的共洗脱脂质作为候选者。作者得出结论，当前的 LC-EAD-MS/MS和MS-DIAL 5 技术可以准确注释共洗脱峰上的最丰富脂质。

图4. 含有长链多不饱和脂肪酸（PUFA）的磷脂酰胆碱（PC）的结构阐明。通过保留时间和m/z轴的散点图显示了深入脂质组分析的结果。分子物种（MSL）、双键（DB）解析、sn-或OH-位置（SN或OH）解析以及m和DB位置或OH和DB位置（SN+DB或OH+DB）解析级别的注释结果由图2b中使用的相同颜色图表描述。确定或未表征的VLC-PUFA的sn1位置分别用三角形和菱形符号表示。右下角面板描述了被注释为PC 34:6(16,19,22,25,28,31)/22:6(4.7,10,13,16,19)的脂质离子的实验图谱。棕色、绿色、橙色和红色光谱峰分别代表与酰基链中的断裂同分异构有关的离子、溶血PC亚结构、sn1-34:6部分的中性损失和前体或极性头部特异性片段。

图5. 小鼠眼组织公共的空间和非靶向脂质组学数据重新分析。a 概述物种/组织特异性脂质数据库统计信息的太阳burst图，使用含有m/z的525种独特脂质的眼脂质体表进行注释。FA、GL、GP、PR、SP和ST的缩写分别表示脂肪酰基、甘油磷脂、甘油磷酸酯、预醇脂、鞘脂和固醇脂。b 美蓝和伊红(HE)染色以及来自Acs10-/-和Acs16-/-小鼠眼组织的MSI数据。显示了五种脂质分子的离子分布。每个前体m/z值的EAD-MS/MS注释用括号标注。c 对于10周龄和2岁龄的Acs10-/-和Acs16-/-小鼠眼组织的公共非靶向脂质组学数据重新分析（生物学独立样本数为3个）。这里，“22:6”表示DHA，而“28:6”、“30:5”、“32:4”、“32:5”、“32:6”、“34:4”、“34:5”、“34:6”、“36:6”和“38:6”被定义为VLC-PUFAs。星号表示除DHA和VLC-PUFA以外的酰基链，总脂质分子标记为‘* DHA’或‘* VLC-PUFA’。‘其他PC’指的是不包含DHA或VLC-PUFA的PC分子的总丰度）。

作者利用小鼠视网膜组织的脂质组学平台对含有超长链多不饱和脂肪酸（VLC-PUFA）的磷脂进行了表征，结果发现VLC-PUFAs主要存在于组织中的PC中。通过优化的固相萃取程序，我们总共对250个峰进行了深入的结构阐明，并分别在分子物种、sn位置解析以及同时在sn和C=C位置解析水平上表征了3、20和10种VLC-PUFA PC分子（图4），特别地，作者发现视网膜组织中的VLC-PUFA主要富集在PC的sn1位置上。通过公开可用的基于CID的非靶向脂质组学数据的眼特异性脂质数据库（图5a）结合用n-3-VLC-PUFA喂养HeLa细胞检测数据。

结果表明，在向培养基中补充n-3-VLC-PUFA时，HeLa细胞中的n-3-VLC-PUFA被证实掺入到溶血磷脂酸（LPA）、PC、二酰基甘油（DG）、三酰基甘油（TG）和胆固醇酯（CE）中，通过EAD-MS/MS分析确认了n-3-VLC-PUFA在HeLa细胞中的sn1位置掺入。结合其它信息，找到了甘油3-磷酸酰基转移酶是将n-3 VLC-PUFAs引入哺乳动物细胞中磷脂的sn1位点的酶，并且与通过EAD-MS/MS和无细胞系统中的重组蛋白结果一致。