【高分文献】P2Y14R作为炎症性肠病的潜在治疗靶点

2024-05-08 18:45:07 309阅读次数

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背景

炎症性肠病（IBD）分为克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），是慢性炎症性肠道疾病，涉及多种细胞类型的动态改变[1]。在临床上，非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂已被批准用于治疗IBD，然而，长期使用这些药物会导致一系列副作用，包括自身免疫反应、病毒感染或肿瘤发生[2,3]。因此，寻找新的IBD治疗有效靶点以及相应的治疗策略仍然是当务之急。

摘要

嘌呤能信号在炎症性肠病的发病机制中起着致病作用。在嘌呤受体中，只有P2Y₁₄R与溃疡性结肠炎患者粘膜活检的炎症评分呈正相关。然而，P2Y₁₄R在溃疡性结肠炎中的作用仍不清楚。通过在实验性结肠炎小鼠肠上皮细胞中P2Y₁₄R过表达，研究发现肠上皮细胞中缺乏P2Y₁₄R的雄性小鼠在葡聚糖硫酸钠（MP Biomedicals, SKU: 02160110 ）诱导下表现出较少的肠损伤。机制上，P2Y₁₄R 的缺失通过 cAMP/PKA 轴限制了cAMP反应元件结合蛋白的转录活性，与Ripk1启动子结合，从而抑制肠上皮细胞的坏死。

此外，研究者还设计了一种结合虚拟筛选和化学优化相结合的分层策略，开发出一种 P2Y₁₄R拮抗剂HDL-16，它具有显著的抗结肠炎作用。该研究阐明了一种之前未知的P2Y₁₄R参与溃疡性结肠炎的未知机制，为炎症性肠病提供了一个有前景的治疗靶点。

实验结果

结果1：肠上皮细胞的P2Y₁₄R参与调节人类IBD和DSS诱导的实验性结肠炎

为了研究P2Y₁₄R在IBD发病机制中的潜在作用，首先分析了公开数据集中 UC 患者肠道活检组织中 P2Y14R的表达情况。结果表明，IECs 中的 P2Y₁₄R 可能在 UC 的发展过程中起着关键作用。

为了进一步深入探讨 P2Y₁₄R 在肠上皮中的参与，研究者培育了在IEC特异性 P2Y₁₄R基因敲除（P2Y₁₄R^ΔIEC）小鼠。然后，用3%DSS刺激P2Y₁₄R^fl/fl和 P2Y₁₄R^ΔIEC小鼠。研究发现IECs特异性P2Y₁₄R基因敲除不会影响接受标准饮用水的小鼠的体重、疾病活动指数（DAI和结肠长度。然而，与P2Y₁₄R^fl/fl小鼠相比，P2Y₁₄R^ΔIEC小鼠在接受DSS处理后体重减轻、腹泻和直肠出血的情况有所缓解。同时，与 P2Y₁₄R^fl/fl小鼠相比，P2Y₁₄R^ΔIEC小鼠的直肠缩短、肠道通透性增加、脾脏指数以及组织学损伤均较小（图1h-k）。

这些结果有力地表明，肠上皮细胞的 P2Y₁₄R 参与了 IBD 的发展。

结果2：肠上皮细胞的P2Y₁₄R可调控上皮细胞坏死

P2Y₁₄R^ΔIEC小鼠IBD表型的改善促使我们对IEC中P2Y₁₄R基因敲除的保护作用的机理进行深入研究。结果表明IEC特异性P2Y₁₄R基因敲除可能通过抑制IEC的坏死并缓解了DSS诱导的结肠炎。研究者在体外实验中也发现相似的结果。

因此，IECs 的P2Y₁₄R在调节 IECs 坏死和DSS诱导的结肠炎中发挥着关键作用。

结果3：P2Y₁₄R通过RIPK1/RIPK3通路调控肠上皮细胞的坏死

据报道，RIPK1和RIPK3的结合可启动坏死体复合物的形成。因此，RIPK1/RIPK3通路与MLKL一起被认为是坏死程序和坏死相关疾病的核心组成部分。

实验结果表明，P2Y14R 通过 RIPK1/RIPK3 通路调控肠上皮细胞的坏死。

结果4：P2Y₁₄R通过抑制CREB与Ripk1启动子的DNA结合能力促进IEC的坏死

为了探索P2Y₁₄R调控Ripk1转录的上游分子机制，利用在线预测网站（Human TFDB、GTRD和UCSC）预测和筛选出可能与Ripk1启动子结合的潜在转录因子（TFs）——CREB。为了证实 CREB 与 Ripk1 启动子之间的结合，进行了ChIP检测。

通过体内和体外实验证实，P2Y₁₄R通过抑制CREB与Ripk1启动子的 DNA 结合能力，促进了IECs的坏死。

结果5：P2Y₁₄R通过调节cAMP/PKA/CREB途径介导Ripk1的转录

鉴于P2Y₁₄R、CREB和cAMP/PKA通路之间的密切联系，研究了TSZ刺激后细胞 P2Y₁₄R 存在或不存在时 cAMP、PKA、CREB的表达情况。结果表明，P2Y₁₄R至少部分地通过改变cAMP/PKA/CREB通路的激活和进一步介导Ripk1的转录来调控IECs的坏死。

结果6：UDP-葡萄糖通过激活P2Y₁₄R促进IECs坏死

根据GEO数据集的分析，UC中P2Y14R信号级联的活性可能不是由于细胞内 UDPG 的积累。IBD患者肠黏膜中Ugp2和Gys1的表达量减少，在DSS患者的IECs中也观察到了这些变化。

为了验证这一假设，通过实验发现UDP葡萄糖的积累可能部分参与了P2Y₁₄R调控IBD中IEC坏死的激活。通过实验发现，服用UDPG会加重DSS诱导的体重下降、腹泻和直肠炎。UDPG-P2Y₁₄R轴通过调节IECs的坏死参与了DSS诱导的炎症调控。

结果7：发现具有预期效力和结合亲和力的P2Y₁₄R拮抗剂

为了寻找一种具有良好拮抗活性和结合亲和力的P2Y₁₄R拮抗剂，以进一步验证P2Y₁₄R在IECs坏死和IBD中的作用，通过结合位点的细化、虚拟筛选、化学优化和体外实验，通过直接结合P2Y₁₄R位点，开发出了强效的P2Y14R拮抗剂HDL-16。

结果8：药理抑制 P2Y₁₄R 可改善 DSS 诱发的结肠炎

通过HDL-16拮抗剂处理DSS诱导的肠炎模型，结果显示每日使用HDL-16或PPTN治疗可显著抑制小鼠结肠炎症状，并维持小鼠肠道屏障的完整性。

总之，P2Y₁₄R拮抗剂可通过抑制IEC坏死和保护黏膜屏障功能来改善DSS诱导的结肠炎。

研究结论

本项研究揭示了P2Y₁₄R在UC发病过程中的关键作用。研究团队基于UC患者和实验性结肠炎小鼠肠道组织中P2Y₁₄R特异性高表达，发现肠上皮细胞P2Y₁₄R敲除可以显著改善DSS造模引起的小鼠体重减轻、稀便和肠道出血。进一步的研究发现，P2Y₁₄R的缺失并不影响肠上皮细胞的凋亡和焦亡，但显著改善了肠上皮细胞的程序性坏死。

通过肠道类器官、转录因子预测及ChIP-qPCR等方法，揭示了P2Y₁₄R依赖PKA/CREB通路促进RIPK1的转录，介导肠上皮细胞的程序性坏死，从而调控UC病程的分子机制。

Z后，利用自主设计合成的P2Y₁₄R小分子抑制剂HDL-16，结合分子生物学和化学生物学手段，明确了HDL-16可通过靶向肠上皮细胞的P2Y₁₄R发挥抗UC的作用，进一步明确了P2Y₁₄R作为炎症性肠病治疗靶标的可行性。

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参考文献：

[1] Adolph, T. E. et al. The metabolic nature of inflammatory bowel diseases. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 19, 753–767 (2022).

[2] Sudhakar, P. et al. Holistic healthcare in inflammatory bowel disease: time for patient-centric approaches? Gut 28, gutjnl-2022–328221 (2022).

[3] Solitano, V. et al. Comparative risk of serious infections with biologic agents and oral small molecules in inflammatory bowel diseases: a systematic review and meta-analysis. Clin. Gastroenterol.Hepatol. 6, S1542–S3565 (2022).

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