PASEF 交响曲 —— caps-PASEF 交联肽段采集新模式

在结构生物学与系统生物学快速发展的今天，科学家们不仅关注蛋白质的序列，更迫切希望揭示其在细胞内的三维构象和相互作用网络。以往如冷冻电镜、X射线晶体学等技术虽能提供高分辨率结构信息，但往往对样品纯度、浓度和状态有较高要求，且难以捕获动态或瞬时的相互作用。交联质谱技术的出现，为在接近生理条件下解析蛋白质结构与互作提供了强有力的工具。

交联质谱（Cross-Linking/Mass Spectrometry, XL-MS）是一种将化学交联剂与质谱技术相结合的方法，能够在天然或近天然状态下捕捉蛋白质内部或蛋白质之间的空间邻近关系。交联剂如同“分子尺”，通过共价连接空间距离内的氨基酸残基（如赖氨酸），形成交联肽段。经过酶切、质谱检测与数据分析，这些交联信息可转化为距离约束，用于构建蛋白质的三维模型或绘制蛋白质相互作用图谱。

与传统方法相比，XL-MS 具有样品用量少、适用体系广（从单一蛋白到全细胞裂解液）、可捕捉动态构象变化等优势，已成为整合结构生物学中不可或缺的工具。

图1. 蛋白交联质谱分析流程

在 XL-MS 实验中，真正的交联肽段仅占肽段总数的极少部分，大量未修饰肽段和单联肽段（仅一端连接交联剂）会严重干扰检测。如何在高背景下精准识别目标信号，一直是该领域的技术难点。

布鲁克 timsTOF 质谱系统集成了捕集离子淌度技术，能够在气相维度根据离子的碰撞截面积（CCS）进行分离。基于此，Scheltema 等人创新性地提出了 caps-PASEF —— 一种基于碰撞截面积辅助的前体离子选择策略。

图2.TIMS技术分离交联肽段和单联肽段

caps-PASEF 的基本原理是：交联肽段与单联肽段在 CCS 和 m/z 两个维度中分布不同。通过定义 CCS–m/z 多边形区域，系统可在采集时实时筛选出可能为交联肽段的离子进行碎裂，从而大幅提高有效谱图的采集效率与鉴定深度。

研究对多种交联剂进行了系统评估：尿素类可裂解交联剂，如 DSBU、DSPU、DSAU。研究发现，具有更长连接臂的 DSBU 由于能捕获更广泛的空间距离，通常能获得最多的交联位点鉴定数。例如在牛血清白蛋白实验中，DSBU 鉴定到的唯一交联位点是 DSAU 的 4-8 倍。磷酸基团可富集交联剂：如 PhoX。该交联剂本身就带有富集标签，再结合 caps-PASEF 的气相筛选，形成了“化学富集 + 物理筛选”的双重净化策略，能将分析目标极致聚焦于真实的蛋白质相互作用信息上。在 PhoX 交联剂富集的样本中可排除 50-70% 的单联肽段干扰，交联肽段鉴定数量提升约 10-20%，尤其在中高等复杂度样本中表现优异。无论是搭配可裂解还是不可裂解的交联剂，caps-PASEF 作为一种采集方法，都能有效工作。其关键在于识别目标离子在淌度上的共性，而非依赖特定的碎裂方式。

图3. caps-PASEF 策略应用于完整细胞裂解液（HeLa lysate）时的全面表现

结合交联质谱（XL-MS）与离子淌度的方法，可有效区分交联肽段与非交联肽段。为了验证该方法解析大型、高复杂度蛋白质的能力，研究者选择了结构清晰的大肠杆菌核糖体作为“标尺”，四次独立的技术重复合并以后成功鉴定出 670 个唯一交联位点。通过离子淌度辅助采集与数据分析，这些位点被清晰地分类与定位，完美地区分出了核糖体亚基内部的连接与不同亚基之间的连接。

图4.大肠杆菌核糖体的交联实验鉴定结果

通过结合 SEC 预分级与高效的离子淌度采集，HEK293T 细胞核裂解液鉴定出 1623 个唯一交联位点，对应 1088 个分子内和 535 个分子间相互作用，最终解析出 564 个独特的蛋白质-蛋白质相互作用网络。该研究证明了 XL-MS 与离子淌度联用的强大能力，不仅可用于解析单个蛋白质的三维结构，更适用于在系统水平上大规模绘制蛋白质相互作用图谱。

图5. SEC预分级策略实现核裂解液交联深度分析

即使通过 caps-PASEF 获得了更“干净”的靶向谱图，如何从海量数据中准确、高效地鉴定出真正的交联肽段，仍是一个巨大的算法挑战。搜索空间呈平方级增长、碎片离子分布不均、谱图解析复杂等问题，都要求一个更强大的计算工具。为此，马克斯·普朗克生物化学研究所的 Jürgen Cox 团队（MaxQuant 的创始团队）推出了全新模块 MaxLynx。作为 MaxQuant 软件生态的一部分，它是一个高度集成、免费使用的专业模块。用户可以在熟悉的 MaxQuant 界面中直接启用 XL-MS 分析流程，实现从原始数据到交联鉴定结果的一站式、自动化处理。

研究团队基于合成肽段和真实复杂样本，将 MaxLynx 与多款主流交联鉴定软件（如 OpenPepXL, pLink2, Xi, Kojak 等）进行了全面对比。结果显示，在严格控制 1% 错误发现率的同等条件下，在合成肽段标准库中使用非裂解型交联剂（DSS），MaxLynx 鉴定出的正确交联肽段谱图匹配数和唯一交联位点数均显著领先，部分数据甚至达到其他软件的 2-4 倍。

图6. MaxLynx 与非裂解型交联剂分析软件在合成数据集上的性能对比

可以说，caps-PASEF 实现了“聪明地采集”，而 MaxLynx 则确保了“准确地解读”。两者的结合，为 timsTOF 平台上的交联蛋白质组学研究提供了一套从仪器方法到数据分析的完整、高效且强大的解决方案。

caps-PASEF 与 timsTOF 质谱仪、MaxLynx 的联合应用，构成了从靶向采集到智能解析的一体化工作流程。这一技术组合能够实现从单一蛋白到全细胞裂解液等不同复杂度样本的高效交联分析，并通过离子淌度筛选与高精度算法确保鉴定结果兼具深度与可靠性。caps-PASEF 不仅是离子淌度与交联质谱技术结合的典范，更是布鲁克 timsTOF 质谱仪在结构蛋白质组学领域功能深化的重要标志。配合 MaxLynx 等先进算法工具，研究人员能够在更短的时间内获得更深、更准的交联数据，从而推动从静态结构到动态网络的多维度生命科学研究。无论是基础科研还是药物发现，这一技术组合正成为揭示蛋白质三维密码的利器。

参考文献

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