EmporeC18膜式固相萃取柱在肽段脱盐过程中的应用

在蛋白质组学研究中，肽段的纯化和脱盐是质谱（MS）分析前的关键步骤。盐分（如SDS、TFA、无机盐等）会干扰质谱信号，降低检测灵敏度。Empore?膜式固相萃取柱（SPE）因其高回收率、低非特异性吸附、易洗脱和易操作的特点，成为肽段脱盐的优选耗材之一。

通过密封压环将Empore?固相萃取膜固定在医用聚丙烯柱管的底部，同时，在固相萃取膜上方集成了8层过滤系统，此过滤系统由三种不同孔径的聚丙烯微纤维过滤层组成（1-3），孔径最大的一层（1）在顶部，孔径最小的5层（3）在底部。上面的两层过滤层各是单独一层（1、2），而具有最小过滤孔径的最底层过滤层（3）是由五层相同孔径的材料构成的复合过滤层。最下面的一层为多孔聚丙烯膜片（4），起到整体的支撑作用。

使用Empore?C18固相萃取柱对酶解后的肽段进行脱盐处理，以提升后续质谱分析的质量。实验过程如下：

1. 材料与试剂

? Empore?C18固相萃取柱（CDS，货号：如98-0604-0198-5EA，4215(SD) C18-SD 7mm/3mL, 50pcs）

? 肽段样品（如胰蛋白酶酶解后的蛋白质样品）

? 试剂：

活化/平衡液：0.1% TFA（三氟乙酸）in 50% ACN（乙腈）

洗涤液：0.1% TFA in 5% ACN

洗脱液：0.1% TFA in 70% ACN

复溶液：0.1% FA（甲酸） in H?O（用于质谱上样）

? 离心机、移液器、收集管等

2. 操作流程

? Step 1：活化固相萃取柱

? 取一支Empore?C18柱，置于离心管中。

? 加入1000μL活化液（0.1% TFA in 50% ACN），1000×g离心1~2min，弃废液。

? 重复1次，确保C18填料充分活化。

? Step 2：平衡柱子

? 加入1000μL洗涤液（0.1% TFA in 5% ACN），离心1~2min，弃废液。

? 重复1次，使柱子处于适合肽段结合的环境。

? Step 3：上样结合肽段

? 将肽段样品（溶于0.1% TFA或低有机相缓冲液）加入柱中。

? 低速离心（500×g，2~3min），使肽段充分吸附在C18填料上。

? 可重复上样以提高回收率（适用于低浓度样品）。

? Step 4：洗涤去盐

? 加入1000 μL洗涤液（0.1% TFA in 5% ACN），离心1~2min，弃废液。

? 重复2次，彻底去除盐分和杂质。

? Step 5：洗脱肽段

? 换新收集管，加入500~1000μL洗脱液（0.1% TFA in 70% ACN），离心1~2min，收集洗脱液（含脱盐后的肽段）。

? 可重复洗脱1次以提高回收率。

? Step 6：真空浓缩或冻干

? 若后续需质谱分析，可用SpeedVac真空浓缩仪干燥样品。

? 复溶于0.1% FA水溶液，准备LC-MS/MS上样。

? 注意事项

? 样品pH：肽段在酸性条件下（0.1% TFA）结合效率更高。

? 有机相比例：洗脱时乙腈比例（70%）可根据肽段疏水性调整。

? 回收率优化：低丰度肽段可减少洗涤次数或增加洗脱体积。

常见问题

? 肽段损失：可能因柱子未充分活化或洗涤过强导致，可优化离心速度。

? 盐残留：洗涤不彻底，可增加洗涤次数或调整缓冲液。

Empore?C18固相萃取柱可用于蛋白质组学样品前处理过程实现肽段脱盐，操作简便，回收率高，重现性好，能提升肽段质谱分析的灵敏度，改善质谱分析的质量。

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