Xevo MRT新型多反射高分辨质谱仪以其杰出的整体性能提供更高的质量分辨率（100,000 FWHM）、更准确的质量数（<500 ppb）、更快的采集速率（100 Hz）是高通量代谢组学、脂质组学、新型污染物筛查、中药及代谢物鉴定、多肽表征及蛋白组学等应用领域研究的理想选择。本应用展示了科学家们通过使用DDA采集模式对磷酸化肽段进行测定，获得磷酸化位点定位、实现蛋白质的鉴定及其通路的研究，从而助力神经胶质细胞瘤新疗法的开发。
图1. Xevo MRT质谱仪。
胶质母细胞瘤是一种侵袭性脑肿瘤，目前几乎没有治疗方案。确诊患者的5年生存率低于10%，中位预期寿命仅为15个月。
磷酸化是一种重要的翻译后修饰（PTM），参与多种过程，例如关键酶/激酶的活化。因此，磷酸化位点成为神经胶质瘤调节和发展进程中的关键靶点。由于磷酰基不稳定，使用质谱法分析磷酸化残基时，可能会产生中性丢失等问题，进而导致鉴定困难。
使用Xevo MRT质谱仪，采用数据依赖型采集（DDA）模式可以完美解决这个棘手的问题：Xevo MRT是一款新型台式高分辨率、高质量精度的质谱仪，能够准确、可靠地表征这些翻译后修饰，同时提供相应的定量数据（图2）。
图2. Xevo MRT质谱仪示意图，展示采用新技术的碰撞室以及无网格Tof，离子束多次反射后质量分辨率可达100,000 FWHM。
图3. 实验流程：在体外对细胞进行精氨酸剥夺处理后，从细胞培养开始到后续的MS分析。
图4. 仪器参数。
使用ProteinLynx Global SERVER(PLGS)处理图3所示工作流程生成的数据。
利用Fe(Ⅲ)-NTA离心柱选择性地结合磷酸肽，允许未修饰的肽通过。初始实验显示，通过富集样品中98 Da的中性丢失可鉴定出大量的磷酸化肽，确保完成全面的研究分析。
数据依赖型采集模式DDA可成功切换信号强度前15的离子，并提供出色的MS/MS谱图用于磷酸化残基的位点定位（图5）。
图5. 匹配的初级离子+肽（序列为AGDLLEDpSPKRPK(上图)LGSLLPVLSPTpSLPpSPLPATLETPVPAFLK(下图)）中性丢失的碎片离子谱图。观测到的磷酰基损失为98 Da的中性丢失，以绿色显示。
使用MetaCore对已鉴定蛋白质进行通路分析，结果符合预期，成功揭示出了与神经系统疾病和细胞骨架蛋白调节相关的通路（图6）。
图6. 未经处理和经处理的单个细胞系中已鉴定蛋白质的通路分析。在“细胞骨架蛋白在少突胶质细胞分化和髓鞘形成中的调节”（左图）和“帕金森氏病神经元中的LRRK2”部分中，绘制出已鉴定的蛋白质。
涉及的相关过程网络也主要集中在翻译、细胞骨架调节和蛋白质折叠。
翻译网络显示，未经处理的细胞和经处理的细胞之间存在差异。
Xevo MRT质谱仪的快速扫描速度与低扫描间隔延迟时间以及高分辨率相结合，实现了蛋白质的鉴定（图7）。
图7. 序列为KQSLGELIGTLNAAK(m/z 811.92835)和AALLKASPK(m/z 489.77270)的双电荷肽MS1谱图。质量误差 <500 ppb。
可行性：使用Fe(Ⅲ)-NTA离心柱可成功富集人胶质母细胞瘤细胞系中的磷酸肽；
可靠性：ACQUITY Premier对磷酸肽表现出优异的非保留性和峰形。
速度与质量兼备：Xevo MRT 质谱仪基于DDA模式采集，采集Top15的数据，在此过程中，能够获得高质量精度的母离子和碎片离子信息，通过软件进行更精确的鉴定和通路分析。
由于磷酸肽在生物样品中的丰度较低，并且CID过程中修饰存在不稳定特性，导致无法充分定位磷酸化位点，使得鉴定尤其困难。尽管如此，在台式Xevo MRT质谱仪上采用与DDA联用的富集策略，仍可成功分析代谢疗法处理前后的人胶质母细胞瘤细胞系的磷酸蛋白质组。
通过网络分析绘制出代谢疗法对蛋白质活化的影响，可为药物发现提供见解，并形成未来分析策略。目前，正开展进一步研究，期望了解这些效应对下游的影响，从而阐明代谢疗法的作用机理。
Xevo MRT质谱仪性能与速度俱佳，同时不妥协于数据质量，助您领跑行业，走在领域前沿。
参考资料
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