全球天然产物分子网络系统（Global Natural Products Social Molecular Networking，GNPS）是一个基于网络的质谱分析生态系统，它通过分子网络分析、谱图库搜索、高通量去重复等功能，助力天然产物和代谢组学研究。其中特征分子网络分析（Feature-Based Molecular Networking，FBMN）是其核心功能之一：它通过计算质谱图间相似性，将结构相似的有机物聚集成簇，形成“分子家族”，这能直观呈现各成分关系，有助于发现结构类似物或新化合物。waters_connect?平台自带的DATA Convert数据转换工具，在数据采集的同时可以直接将数据转换为.mzML通用格式，能够非常方便兼容第三方软件进行数据处理。本实验以绿茶提取物为例，演示如何基于Xevo MRT MS和GNPS1进行天然产物成分分析。：
图1.工作流程图。
数据处理软件
使用waters_connect进行数据采集，后续使用Progenesis QI或MS DIAL进行数据预处理后导出文件，上传预处理文件至GNPS网站进行特征分子网络分析。
实验流程
Step 1
数据预处理：在进行特征分子网络分析之前，首先需要借助代谢组学软件进行数据预处理（峰提取，峰对齐，样本分组，解卷积等），waters_connect平台自带的DATA Convert数据转换工具，在进行数据采集的同时可以直接将数据转换为.mzML通用格式，供Progenesis QI，MS DIAL2，Mzmine3，XCMS4等组学软件对数据进行处理，这确保了在适应多样化工作流程时具备相当高的灵活性，同时通用格式也简化了跨团队的数据共享。以官方组学软件Progenesis QI为例，在使用其完成数据预处理后，可以选择导出“Feature quantification table”和“MS2 MGF”两个文件，用于后续的FBMN分析。
图2. Progenesis QI导出数据示例图。
此外，以第三方代谢组学软件MS DIAL为例，可以选择直接加载.mzML格式数据，数据导入并处理后可以得到5,559个特征离子的MS/MS谱图。
图3. MS DIAL预处理结果图。
在MS DIAL菜单栏，选择“Export>Alignment result”，可导出“Feature quantification table”和“MS2 MGF”两个文件，用于后续的FBMN分析。
图4. MS DIAL导出数据示例图。
Step 2
FBMN分析：登录GNPS网站，选择“Feature Networking”（注意和“Molecular Networking”有区别），进入FBMN界面，提交上述的两个文件；此外可以选择加载.msp格式的MS/MS数据库（程序会自动加载GNPS网站自带的数据库包），并适当调整峰提取参数后，提交并等待结果。
图5. 数据上传GNPS示例图。
Step 3
通过GNPS网站搜索库共得到203个化合物的鉴定结果，包含84种黄酮、22种酚酸、9种苯丙素、12种有机酸及其衍生物、12种核苷、5种香豆素、6种糖类、19种脂质，以及34种其他类型化合物。
Step 4
通过FBMN分析，可以得到236个分子网络团簇。
表1. 分子网络结果。
01
以第一个分子网络为例，共有94个节点，其中离子m/z 441.0833 GNPS搜库结果为Epicatechin gallate（表儿茶素没食子酸酯），与其结构相似度较高的离子有m/z 417.0825、m/z 425.0886、m/z 431.0980、m/z 455.0992、m/z 457.0775，除m/z 457.0775被鉴定为Epigallocatechin Gallate之外，其余四个离子均未被GNPS搜索库匹配到。
图6. 可视化分子网络。
02
以离子m/z 425.0886为例，其与Epicatechin gallate的MS/MS谱图对比如图所示，存在两个共有碎片离子125、169，对应没食子酸基团；另外，两者有多个碎片离子质荷比相差16(少一个羟基)，表明该物质黄酮骨架上缺少一个羟基基团；最终推测其为Epiafzelechin-3-O-gallate。 m/z 425.0886、m/z 441.0833、m/z 457.0775三个化合物属于结构类似物，都含有没食子酸基团，主要区别在于黄酮骨架上酚羟基的数目不同。
图7. Epicatechin gallate与类似物的MS/MS对比图。
03
再以m/z 459.0939为例，其与m/z 457.0775 Epigallocatechin Gallate的MS/MS谱图对比如图所示，同样存在两个共有碎片离子125、169，表明其存在没食子酸基团；另外存在一个质荷比相差2的离子（2H），推测其黄酮骨架发生了加氢开环反应，未见文献报道，可以对其结构进行合理推测。
图8. Epicatechin Gallate与类似物的MS/MS对比图。
Step 5
使用waters_connect平台进行结果验证。 分别为m/z 425.08、m/z 441.08、m/z 457.07和m/z 459.09对应的二级谱图及推测分子结构，并基于waters_connect平台对其二级碎片进行了结构注释，它们各自所有的高强度碎片离子均被注释，进一步表明了推测结果的合理性。
图9. 基于waters＿connect进行分子结构注释图。
实验结论
使用Xevo MRT MS联合GNPS对绿茶提取物进行化学成分分析：
waters_connect平台自带的DATA Convert数据转换工具，在数据采集的同时可以直接将数据转换为.mzML通用格式，能够非常方便地供Progenesis QI、MS DIAL等组学软件对数据进行处理，提高数据分析效率；
GNPS利用Xevo MRT MS提供的高质量MS/MS谱图，可以快速鉴定到203个化合物，包含84种黄酮、22种酚酸、9种苯丙素、12种有机酸及其衍生物、12种核苷、5种香豆素、6种糖类、19种脂质，以及34种其他类型化合物，该方法也可以应用于其他复杂天然产物样品的快速分析鉴定；
通过FBMN分析，可以得到236个分子网络团簇，其中以m/z 441.0833 epicatechin gallate为例，可以找出6种结构类似物，其中有5种未被GNPS注释鉴定，通过MS/MS谱图比对和结构解析，分别被推测鉴定，并基于waters_connect平台对其分子结构进行注释验证，其中包含一种未被文献报道的物质，应该属于绿茶提取物中新发现的化合物。
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参考文献
[1] Louis-Félix Nothias, et al. "Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment."
Nature Methods(2020):1-4.
[2] Tsugawa, Hiroshi , et al. "MS-DIAL: data-independentMS/MS deconvolution for comprehensive
metabolome analysis." Nature Methods12.6(2015):523-526.
[3] Heuckeroth, Steffen, et al. "Reproducible mass spectrometry data processing and compound
annotation in MZmine 3." Nature Protocols 19.9(2024).
[4] Forsberg, etal. "Data processing, multi-omic pathway mapping, and metabolite activity analysis using XCMS Online." Nature Protocols Erecipes for Researchers (2018).
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