液相-原子荧光光谱联用测试鱼肌中总硒和形态硒含量方法研究

硒（Se）作为人体不可缺少的微量元素之一，适量的硒有利于甲状腺功能的正常发挥，具有提高免疫力、促进治疗心血管疾病、促进胃肠道消化、改善精神疾病和预防上呼吸道感染的作用。而少量或过量的硒则可能带来负面影响，人体硒摄入不足时，会导致癌症、心脑血管病、肝病、糖尿病、大骨节病等多种疾病，摄入过量时，会造成头发、指甲脱落，神经系统受损，瘫痪、恶心、头疼等症状。除了总硒含量外，硒的不同形态对人体带来的影响也不同。有研究表明，人体内硒的生物活性不仅取决于摄入的总硒量，还和硒的化学形态密切相关。食物中硒的形态主要有亚硒酸盐Se（Ⅳ）、硒酸盐Se（Ⅵ）、硒代胱氨酸SeCys、硒代蛋氨酸SeMet，前两者属于无机硒，后两者属于有机硒。一般情况下，无机硒的毒性大于有机硒的毒性，无机硒中亚硒酸盐Se（Ⅳ）的毒性又大于硒酸盐Se（Ⅵ）。鱼类是含硒量较高的动物，有机硒是鱼肌中主要的硒形态，是人体摄入硒的主要来源，在人体中起着重要的作用，可促进人体内氧化物的分解、防止身体器官老化、预防心脏病和预防风湿性关节炎等。有机硒参与人体代谢，能够被人体吸收，而未被转化的无机硒不易被人体吸收，且毒性较大。如今市面上很多的富硒产品质量良莠不齐，部分产品通过加入有毒性的无机硒来提高硒的含量，对人体健康产生威胁。因此，对鱼肌中硒元素的总量和各形态的定量分析具有很重要的现实意义。

本实验室以硝酸和过氧化氢消解鱼肌样品，以盐酸溶液定容后，通过原子荧光光谱法对溶液总硒含量进行三次平行测定，并进行加标回收实验，结果如表1所示。总硒浓度在0-10μg/L内线性关系良好，标准曲线相关系数大于0.999，检出限为0.09 μg/L，相对标准偏差（RSD）为0.77％，加标回收率为104.2％，表明方法准确度较好。

表1  鱼肌样品的总硒加标回收率

之后，本实验室优化高效液相色谱-原子荧光光谱法的测试参数以分析形态硒，调节流动相（磷酸氢二铵5.28 g/L）的pH值分别为5.00、6.00、7.00、8.00，观察其对硒的4种形态的分离程度和灵敏度的影响，结果如图1所示，pH为6.00的磷酸氢二铵缓冲溶液作为流动相效果较好。

空心阴极灯电流的大小，决定了激发光源的强弱，空心阴极灯灯电流越大则激发光源越强，灵敏度越高，但灯电流过大会导致灯的使用寿命降低。本研究探究不同灯电流值（40、50、60、70、80、90、100、110 mA）对形态硒信噪比（db）的影响，信噪比由db=10 lg（s/n）算出，其中s为峰高，n为基底，结果如图3所示。随着灯电流的升高，4种形态硒信噪比都有先增大后减小的趋势，在灯电流为50mA时信噪比最大，过高的灯电流会降低空心阴极灯的使用寿命，故选用灯电流为50mA。

图3  不同灯电流对信噪比的影响

配制5组不同体积分数的盐酸溶液（6％、7％、8％、9％、10％）对硒混合标准溶液进行测定，研究不同盐酸体积分数对形态硒峰面积的影响，结果如图4所示。随着盐酸体积分数的增加，形态硒的峰面积先增加后减小。当盐酸体积分数为9％时，4种形态硒的峰面积达到最高值，再增加盐酸体积分数，峰面积出现下降趋势。因此，选用9％的盐酸溶液作为载流。

配制质量浓度不同的硼氢化钾溶液（15、20、25、30、35 g/L），对硒混合标准溶液进行测定，研究不同质量浓度的硼氢化钾溶液对形态硒峰面积的影响，结果如图5所示。随着硼氢化钾浓度的增加，形态硒的峰面积先增加后减小，当硼氢化钾的质量浓度达到20 g/L时，各形态的峰面积最大，过高的硼氢化钾浓度会导致产生过量的氢气，在一定程度上稀释由各形态硒组分形成的原子蒸气，从而使各组分的峰面积降低。因此，采用硼氢化钾的质量浓度为20 g/L。

在优化的条件下，对质量浓度为100 μg/L 的标准溶液进行测定，结果如图6所示。在22 min 之内，SeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）依次出峰，实现完全分离，峰形较好，保留时间分别为2.283、4.067、5.233、18.467 min。

图6  优化条件下形态硒的标准谱图

对各价态进行测试，分别对鱼肌样品在消解前和消解后加标，检测加标回收率，结果如表2和表3所示。硒代胱氨酸、亚硒酸盐、硒代蛋氨酸、硒酸盐等4种形态硒的标准曲线在10~200μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，各形态消解前加标的加标回收率在91.6％~108.9％之间，消解后加标的加标回收率在90.1％~109.7％之间，结果表明该方法对鱼肌形态硒测定有很好的准确性和可靠性。

表2  鱼肌样品的4种形态硒加标回收率（消解前加标）

表3  鱼肌样品的4种形态硒加标回收率（消解后加标）

图7 海洋三所同位素实验室液相色谱-原子荧光联用设备

相关技术问题交流，可联系海洋三所分析测试中心林梵宇博士（QQ：175693753）

参考文献：

刘建鑫,尹希杰,林梵宇,等. 高效液相色谱-原子荧光光谱法分析鱼肌中的总硒和形态硒[J]. 分析仪器,2024(2):53-58.