LIF检测器校准流程自动和手动

来源：SCIEX（爱博才思）分类：操作使用

2025-02-08 10:12:26 61阅读次数

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LIF检测器作为一种高灵敏度检测方式在生物制品分析领域显示出其它检测器不可比拟的优越性，应用范围越来越广，包括蛋白药的高灵敏纯度分析、糖型分析、质粒的纯度分析、mRNA的纯度分析等等多个方面。与应用较多的紫外-可见吸收检测器（UV）和二极管阵列检测器（PDA）相比，LIF检测器表现出许多优点：

极高的灵敏度：比UV、PDA高出2～3个数量级，对于某些荧光效率高的荧光试剂甚至可以实现单分子检测，达到了分子级别的高灵敏度。

? 基线干扰更小：信噪比更高，更加便于数据积分处理；

良好的状态是保证实验的关键，所以每当安装新毛细管、更换卡盒或者重新安装 LIF 检测器时，均需要对 LIF 检测器进行校准。接下来，小编就带您一起熟悉一下LIF检测器的校准流程。

校准方式及试剂

当采用发射光为520 nm的波长采集时，使用100um内径毛细管时建议执行下文第二部分的手动校准流程，其他内径毛细管可执行自动校准流程，需要的试剂如下；

试剂	货号
LIF Performance Test Mix	726022
RUN BUFFER A	338426
DDI Water	N/A

校准所需试剂

自动校准流程

重要：用户必须拥有仪器管理的权限

1.PA 800 Plus 仪器处于关机状态安装 LIF 检测器。

2.打开仪器及激光器，并使 LIF 激光器预热 30 分钟。

3.运行32Karat。

4.点击Tools＞Enterprise Login以管理员身份登录。

5.选择CHO仪器图标，然后右键Configure＞Instrument。

6.在仪器配置窗口上选择Configure。

7.双击选择PA 800 Plus System Configuration右侧的LIF Detector图标。

8.32Karat 软件配置对话框出现，如图1：

图1. 32Karat 软件对话框

9.在软件配置对话框中选择LIF Calibration Wizard展示校准向导，如图2

执行校准

1. 在校准选项中选择Auto，如图2并点击Next。

图2. 校准向导界面——选择Auto

2. 设置目标RFU值，毛细管内径为100 μm时，目标RFU值输入62，毛细管内径为50 μm时，目标RFU值输入15；毛细管长度为实际长度。如图3并点击Next。

图3. 校准向导界面——第二步

摆放样品瓶并校准检测器

1) 向电泳小瓶内加入 1.5 mL 的 Capillary Performance Run Buffer A 溶液并放置在右图的样品盘位置上。

2) 向内衬管中加入 200 μL 比值为 1:1 的 LIF Performance Test Mix：Capillary Performance Run Buffer A 溶液，并放置在右图的样品盘位置上。

3) 在废液瓶的位置上放置一个空的电泳小瓶。

4) 点击 Next

注：如使用涂层毛细管，使用DDI water代替run buffer A；自动校准之前建议先用A1位置溶液20psi冲洗毛细管5min

图4. 校准向导界面——第三步

校准结束后，会有一个对话框出现，如图5。在校准因子区域会出现一个数字。如果数字在0.1—10之间，选择Accept并结束校准。如果数字大于10或小于0.1，请查看CCF问题排查过程。

图5. 校准向导界面——第四步

手动校准流程

重要：用户必须拥有仪器管理的权限

当使用100um内径毛细管时建议使用手动校准

1. PA 800 Plus 仪器处于关机状态安装 LIF 检测器。

2. 打开仪器及激光器，并使 LIF 激光器预热 30 分钟。

3. 运行32Karat。

4. 点击Tools＞Enterprise Login以管理员身份登录。

5.选择CHO仪器图标，然后右键Configure＞Instrument。

6. 在仪器配置窗口上选择Configure。

7. 双击选择PA 800 Plus System Configuration右侧的LIF Detector图标。

8. 32Karat 软件配置对话框出现，如图1:

图1. 32Karat 软件对话框

9. 在软件配置对话框中选择LIF Calibration Wizard展示校准向导，如图2

图1. 32Karat 软件对话框

执行校准

1. 在校准选项中选择Manual，如图2并点击Next。

图2. 校准向导界面——选择Auto

2. 在弹出的校准结果界面，将CCF值改为1，如图3.Accept CCF值，关闭校准界面。

图3. 手动校准界面

3. 登录仪器操作模块，在菜单栏file→method→new，新建方法。编辑LIF calibration方法，如下图：

4. 运行LIF calibration方法，

5. 计算校准因子：Factor=理论值RFU/实测值RFU。

注：毛细管内径为100 μm时，理论RFU值62，毛细管内径为50 μm时，理论RFU值15；

6. 手动输入校准因子：打开LIF校准向导，重新选择Manual，点击Next，在弹出的对话框中输入channal 1的计算校准因子。

CCF问题排查过程

CCF ＜ 1

问题	纠正方向
CCF值在0.1至1之间	· 系统没有问题，运行一个标准品并验证系统可接受的性能。
系统性能不被接受或CCF值小于0.1	· 确保毛细管完好。 · 确保激光光源的打开。 · 确保滤光片正确的安装在LIF检测器中。 · 联系SCIEX售后工程师。

CCF ＞ 1

问题	纠正方向
CCF值在1至10之间	· 运行一个标准品检测仪器性能是否能被接受。
系统性能不被接受或CCF值小于0.1	? 确保激光光源的打开。 ? 确保滤光片正确的安装在LIF检测器中。 ? 更换试剂和毛细管重新进行校准。 ? 联系SCIEX售后工程师。