细胞又双叒死了？可能是内毒素这个"隐形杀手"在捣鬼

细胞莫名死亡、转染效率低至30%、同样的protocol却做不出同样的结果——遇到这些情况，你的第一反应是什么？

细胞状态不好？血清批次有问题？转染试剂不给力？

很少有人会想到是内毒素在“捣乱”吧？它隐藏在细胞培养基、添加物、质粒中，难以被发现，却悄无声息地吞噬着实验数据和结果。内毒素可能从一开始就在那里，只是你从来没测过。

什么是内毒素

内毒素（Endotoxin）是革兰阴性菌外膜中独特的结构成分，主要成分是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。革兰氏阴性菌具有双层细胞膜，其外膜内叶含有磷脂，外叶含脂多糖。LPS占外膜总分子的10-15%，但占外膜总表面积的75%。因此，脂多糖最基本的作用是将外膜转变为革兰氏阴性菌有效屏障，对抗菌化合物产生天然抵抗力。

细菌在正常生长和繁殖过程中仅释放少量内毒素，大部分用于维持结构稳定。但是在菌体裂解、自溶或死亡后会大量释放内毒素，展现出强大的毒性。来自不同细菌的内毒素毒性大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克、血管内凝血等不良反应。

内毒素有哪些结构特征？

LPS的基本结构高度保守，包括三部分：从内到外依次为脂质A（Lipid A）、核心多糖（Oligosaccharide core）和O-抗原（O-antigen，也称之为O-特异性侧链）。根据LPS是否含有O-抗原，又可分为光滑型LPS（Smooth LPS, S-LPS）和粗糙型LPS（Rough LPS, R-LPS，也称为脂寡糖）。

革兰氏阴性菌的内毒素组分

（源自文献：doi: 10.3390/toxins13080533）

内毒素对细胞培养的多方位伤害

内毒素会造成细胞形态发生明显变化，如体积缩小、折光率降低等，还抑制细胞的增殖。内毒素在敏感细胞中诱导caspase-3介导的凋亡通路，使原代细胞存活率骤降。其磷酸基团能与细胞膜上的蛋白质反应，或其脂肪酸链与脂质膜和蛋白质亲水区发生作用，改变细胞膜形态，导致细胞功能障碍。

LIU等人通过MTT法测定了脂多糖（LPS，内毒素的主要成分）对H292和THP-1细胞的毒性作用。结果发现，与未处理的对照组相比，低浓度（1-2.5 μg/mL） LPS处理后，细胞活力未观察到显著变化，表明此浓度下的LPS对细胞无毒性。而高浓度（5-20 μg/mL）的LPS对H292和THP-1细胞具有显著的细胞毒性。

LPS刺激对H292与THP-1细胞活力的影响

（源自文献：DOI: 10.3892/mmr.2018.8542）

Schwarz H等人发现0.02-2 ng/mL的内毒素（LPS）能激活细胞的免疫反应，且不同细胞对内毒素的敏感度不一样。如THP-1细胞在受到最高浓度LPS（2 ng/mL）刺激时，仅IL-8表达量显著增加，而在相同浓度下，moDCs会大量分泌IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α。人单核细胞和CD1c+ DCs对内毒素更敏感，0.2 ng/mL的LPS能够诱导所有细胞因子释放。

低浓度LPS对不同人类免疫细胞细胞因子产生的影响

（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

重组蛋白内毒素对细胞培养的影响

重组细胞因子在细胞培养和扩增分化过程中具有重要作用。免疫学实验、细胞凋亡实验、干细胞培养与分化、类器官模型构建等，都需要使用低水平内毒素的细胞因子。细胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平内毒素的重组蛋白是获取可靠实验结果的基础。

为评估重组蛋白中内毒素对细胞的免疫反应，Schwarz H等人构建了对LPS高度敏感的HEK293细胞。将这些细胞分别暴露于不同浓度的重组蛋白（来自两个不同的供应商）和LPS中。结果显示，供应商1的重组蛋白可使NF-kB表达量升高，而供应商2的重组蛋白则未激活NF-kB表达。供应商1重组蛋白诱导NF-kB表达的效果与0.02 ng/mL LPS相近，说明重组蛋白中少量内毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng蛋白）足以激活NF-κB通路。

内毒素对HEK293细胞中NF-kB激活的影响

（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

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【参考文献】

1.Rosalia Marcano, et al. Pathological and Therapeutic Approach to Endotoxin-Secreting Bacteria Involved in Periodontal Disease. Toxins 2021, https://doi.org/10.3390/toxins13080533

2.Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840

3.Xuefang Liu, et al. LPSinduced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542