探究 RNA 转染实验效率低下的缘由

一、引言

二、影响 RNA 转染效率的因素分析

（一）RNA 质量与结构

1. RNA 纯度

• RNA 样本中若含有蛋白质、DNA、有机溶剂等杂质，会显著影响转染效率。例如，蛋白质杂质可能与 RNA 竞争转染试剂的结合位点，从而减少有效转染复合物的形成；DNA 杂质则可能干扰 RNA 与细胞内受体的相互作用，导致转染过程受阻。

• 检测方法：通过紫外分光光度计测定 RNA 在 260nm、280nm 和 230nm 处的吸光值，计算 A260/A280 和 A260/A230 比值。纯净的 RNA 样品，A260/A280 比值应在 1.8 - 2.0 之间，A260/A230 比值应大于 2.0。若比值偏离正常范围，提示 RNA 可能存在杂质污染。

2. RNA 完整性

• 降解的 RNA 分子结构不完整，无法有效参与转染过程中的一系列生物化学反应，导致转染效率降低。RNA 在提取、保存和处理过程中容易受到核糖核酸酶（RNase）的降解。

• 检测方法：采用琼脂糖凝胶电泳分析 RNA 的完整性。完整的 RNA 在凝胶上会呈现出清晰的 28S、18S 和 5S 核糖体 RNA 条带，且 28S 条带的亮度应约为 18S 条带的两倍。若出现条带模糊、拖尾或缺失等现象，则表明 RNA 可能已发生降解。

3. RNA 二级结构

• RNA 分子具有复杂的二级和三级结构，某些特定的二级结构可能会阻碍转染试剂与 RNA 的结合，或者影响 RNA 进入细胞后的解旋和释放过程，从而降低转染效率。

• 预测方法：利用生物信息学软件如 RNAfold 等对 RNA 序列进行二级结构预测。分析预测结果中是否存在可能影响转染的稳定二级结构，如茎环结构、发夹结构等。对于具有复杂二级结构的 RNA，可以尝试通过优化实验条件（如提高转染温度、使用特殊的转染试剂等）或对 RNA 进行适当的预处理（如热变性等）来降低其对转染效率的影响。

（二）转染试剂特性

1. 转染试剂类型

• 不同类型的转染试剂其转染原理和适用范围各不相同，对 RNA 转染效率的影响也存在差异。例如，阳离子脂质体转染试剂通过静电作用与带负电的 RNA 结合形成复合物，然后通过内吞作用进入细胞；而聚合物转染试剂则依靠其与 RNA 形成的纳米颗粒来实现细胞摄取。某些转染试剂可能对特定类型的细胞或 RNA 具有更高的转染效率。

• 选择策略：在进行 RNA 转染实验前，需要充分了解不同转染试剂的特点和适用范围，并根据实验目的、细胞类型以及 RNA 的性质等因素进行合理选择。同时，可以参考相关文献或进行预实验，比较不同转染试剂在相同实验条件下的转染效率，以确定最适合的转染试剂。

2. 转染试剂毒性

• 转染试剂在促进 RNA 进入细胞的过程中，可能对细胞产生一定的毒性作用，影响细胞的正常生理功能和存活状态，进而导致转染效率下降。高毒性的转染试剂会引起细胞凋亡、形态改变、代谢紊乱等不良反应，降低细胞对 RNA 的摄取和处理能力。

• 评估方法：通过细胞活力检测实验如 MTT 法、CCK - 8 法等评估转染试剂对细胞的毒性。在转染实验过程中，设置不同浓度的转染试剂处理组，同时设立未处理的对照组，在转染后的特定时间点检测细胞活力。选择在保证较高转染效率的前提下，对细胞毒性较小的转染试剂浓度进行后续实验。

3. 转染复合物稳定性

• 转染试剂与 RNA 形成的复合物在细胞培养液中的稳定性对转染效率至关重要。不稳定的复合物可能在进入细胞前就发生解离，导致 RNA 无法有效递送到细胞内。复合物的稳定性受到多种因素的影响，如转染试剂与 RNA 的比例、溶液的离子强度、pH 值等。

• 优化方法：在制备转染复合物时，严格按照转染试剂说明书的要求控制转染试剂与 RNA 的比例。同时，注意优化转染过程中的溶液条件，保持适当的离子强度和 pH 值。可以通过在不同条件下制备转染复合物，并检测其在一定时间内的稳定性（如通过动态光散射技术测量复合物粒径的变化等），来确定最佳的转染复合物制备条件。

（三）细胞因素

1. 细胞类型

• 不同类型的细胞其细胞膜结构、表面受体表达、内吞途径以及代谢活性等方面存在显著差异，这些因素都会影响 RNA 的转染效率。例如，一些贴壁细胞如 HeLa 细胞、HEK293 细胞等相对容易转染，而某些原代细胞或悬浮细胞则转染难度较大。

• 应对策略：针对不同类型的细胞，需要优化转染条件。对于难转染的细胞，可以尝试采用特殊的转染方法或转染试剂，如电穿孔法、病毒载体介导的转染等。此外，还可以通过对细胞进行预处理（如使用细胞松弛素 B 等药物增加细胞膜的通透性）或共转染一些辅助因子（如阳离子聚合物等增强细胞对 RNA 的摄取能力）来提高转染效率。

2. 细胞生长状态

• 处于对数生长期的细胞具有较强的代谢活性和分裂能力，对 RNA 的摄取和处理能力也相对较高，因此转染效率通常较高。而处于静止期或老化状态的细胞，其生理功能下降，转染效率会受到明显影响。

• 控制方法：在进行 RNA 转染实验前，确保细胞处于良好的生长状态。定期传代培养细胞，使细胞始终保持在对数生长期。通过细胞计数和显微镜观察等方法监测细胞的生长状态，选择合适的细胞密度进行转染实验。一般来说，细胞密度在转染时应达到 70% - 90% 左右，但具体密度还需根据细胞类型和实验要求进行调整。

3. 细胞 passages 次数

• 随着细胞传代次数的增加，细胞可能会发生遗传变异和表型改变，导致其转染效率逐渐下降。此外，长期培养的细胞可能会积累一些细胞培养过程中的应激因素，影响细胞的正常功能和对 RNA 的响应能力。

• 注意事项：尽量使用低 passages 次数的细胞进行实验。在细胞培养过程中，记录细胞的传代次数，并定期对细胞的转染效率进行检测。如果发现细胞转染效率随着 passages 次数的增加而明显降低，应重新复苏早期 passages 的细胞或从可靠的细胞库获取新的细胞株。

（四）实验操作环境

1. 无菌操作

• RNA 转染实验要求严格的无菌操作环境，以防止微生物污染对细胞和实验结果的影响。微生物污染可能导致细胞生长异常、死亡或产生炎症反应，从而干扰 RNA 转染过程。例如，细菌或真菌产生的毒素可能影响细胞的膜通透性和代谢功能，降低转染效率。

• 操作规范：在实验过程中，所有涉及细胞培养和 RNA 处理的操作均应在无菌超净工作台内进行。使用无菌的培养器具和试剂，定期对超净工作台进行清洁和消毒。在操作前，对手部进行严格消毒，穿戴无菌手套和口罩。同时，注意避免将外界的微生物带入实验环境，如避免在操作过程中频繁打开超净工作台的门等。

2. 温度和湿度

• 实验环境的温度和湿度对 RNA 转染效率也有一定的影响。温度过高或过低可能影响细胞的生理状态和代谢活性，进而影响 RNA 的摄取和转染效果。湿度不合适可能导致培养液蒸发过快或过慢，影响细胞的生长环境和转染试剂的稳定性。

• 控制条件：一般来说，细胞培养和 RNA 转染实验应在 37°C、5% CO₂的培养箱中进行，培养箱内的湿度应保持在相对稳定的水平（通常为 95% 左右）。在实验过程中，定期检查培养箱的温度和湿度参数，确保其符合实验要求。如果实验环境的温度和湿度波动较大，可以考虑使用恒温恒湿培养箱或在实验室内安装空调和除湿设备等进行调节。

3. 震动和干扰

• 在 RNA 转染过程中，细胞培养板或培养皿的震动以及外界的电磁干扰等因素可能会影响转染复合物与细胞的结合和摄取过程，从而降低转染效率。例如，剧烈的震动可能导致转染复合物从细胞表面脱落，而电磁干扰可能影响细胞内的信号传导和代谢过程，间接影响 RNA 转染效果。

• 避免措施：在转染过程中，尽量将细胞培养板或培养皿放置在平稳的实验台上，避免不必要的震动和移动。同时，将实验设备远离强电磁场源，如电机、变压器等。在进行细胞培养和转染操作时，创造一个安静、稳定的实验环境，以确保转染实验的顺利进行。

三、结论与展望