如何达到较高的 RNA 转染效率？

一、引言

二、影响 RNA 转染效率的因素

（一）RNA 质量

1. 纯度：高纯度的 RNA 是确保转染效率的基础。RNA 样本中若含有蛋白质、DNA、有机溶剂等杂质，会影响转染试剂与 RNA 的结合以及后续进入细胞的过程。例如，残留的 DNA 可能与 RNA 竞争转染试剂，导致有效转染复合物的形成减少。

2. 完整性：完整的 RNA 分子结构对于其在细胞内的稳定性和功能发挥至关重要。降解的 RNA 不仅转染效率低，还可能无法正确表达目标基因。在 RNA 提取和处理过程中，应避免剧烈的物理或化学条件，如过度的涡旋、长时间的高温等，以防止 RNA 断裂。

（二）转染试剂

1. 类型：不同类型的转染试剂具有不同的转染机制和适用范围。阳离子脂质体转染试剂通过静电作用与带负电的 RNA 结合，形成脂质体 - RNA 复合物，易于被细胞摄取。然而，其细胞毒性相对较高，可能影响细胞活性和转染效率。聚合物转染试剂如聚乙烯亚胺（PEI），具有较高的转染效率和较低的细胞毒性，但可能会引起细胞内的免疫反应。病毒载体转染试剂如腺病毒、慢病毒等，转染效率极高，但存在潜在的安全风险和复杂的制备过程。

2. 电荷比：转染试剂与 RNA 的电荷比是影响转染复合物形成和稳定性的重要因素。合适的电荷比能够确保复合物的有效形成并促进其与细胞表面的相互作用。过高的电荷比可能导致复合物过于稳定而难以被细胞内吞，过低的电荷比则可能使复合物不稳定，容易在细胞外解离。

（三）细胞类型

1. 细胞来源和特性：不同来源的细胞（如原代细胞、肿瘤细胞系、干细胞等）具有不同的细胞膜结构、代谢水平和基因表达模式，对 RNA 转染的敏感性差异显著。例如，原代细胞通常较难转染，因为其具有更为复杂的细胞外基质和较低的分裂活性。而一些肿瘤细胞系由于其快速增殖和较高的代谢活性，可能相对更容易转染。

2. 细胞生长状态：处于对数生长期的细胞具有较强的代谢活性和分裂能力，对 RNA 转染的接受度更高。相反，处于静止期或老化状态的细胞，转染效率往往较低。因此，在进行转染实验前，应确保细胞处于良好的生长状态，及时传代并控制细胞密度。

（四）转染条件

1. 转染试剂与 RNA 的混合方式和时间：正确的混合方式能够确保转染试剂与 RNA 充分结合，形成均一的转染复合物。一般来说，应将转染试剂缓慢滴加到 RNA 溶液中，并轻轻混匀。混合时间也需要适当控制，过短可能导致结合不完全，过长则可能增加复合物的不稳定性。

2. 转染时间和剂量：转染时间过长可能导致细胞毒性增加，影响细胞活性和转染效率；转染时间过短则可能使 RNA 无法充分进入细胞。转染剂量同样需要优化，过高的剂量可能引起细胞的免疫反应或毒性反应，过低的剂量则无法达到预期的基因表达水平。应根据细胞类型和实验目的，通过预实验确定最佳的转染时间和剂量。

三、提高 RNA 转染效率的策略

（一）优化 RNA 质量

1. 严格的 RNA 提取和纯化：采用高质量的 RNA 提取试剂盒，并遵循操作规程，确保 RNA 的纯度和完整性。在提取过程中，可加入适量的 RNase 抑制剂，防止 RNA 降解。提取后，可通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计等方法对 RNA 质量进行检测和评估。

2. RNA 的修饰和处理：对 RNA 进行适当的修饰，如 5' 端帽子结构的添加、3' 端 poly (A) 尾巴的延长等，可以提高 RNA 的稳定性和翻译效率，进而增强转染效果。此外，还可以使用 RNA 稳定剂，如 RNAlater 等，在 RNA 储存和处理过程中保持其稳定性。

（二）选择合适的转染试剂

1. 根据实验需求和细胞类型选择：对于难以转染的细胞，如原代细胞，可优先考虑使用病毒载体转染试剂或具有较高转染效率的聚合物转染试剂。对于需要长期观察基因表达的实验，应选择细胞毒性较低的转染试剂。同时，还应考虑转染试剂的价格、操作简便性等因素。

2. 优化转染试剂的使用条件：按照转染试剂说明书推荐的方法进行操作，并通过预实验优化转染试剂与 RNA 的电荷比、混合方式和时间等参数。对于一些特殊的细胞类型或实验要求，可能需要对转染试剂进行适当的改良或定制。

（三）培养细胞的优化

1. 细胞的选择和培养：选择适合实验目的的细胞类型，并确保细胞来源可靠、无污染。在细胞培养过程中，提供适宜的培养基、温度、湿度和气体环境，定期更换培养基，保持细胞的良好生长状态。对于原代细胞，可采用特殊的培养方法和添加生长因子等措施，提高其转染效率。

2. 细胞密度的控制：在转染前，将细胞接种至适当的密度。一般来说，细胞密度应在 50% - 80% 之间，此时细胞具有较好的生长活性和对转染的接受能力。过高或过低的细胞密度都可能影响转染效率。

（四）优化转染条件

1. 精确控制转染时间和剂量：通过预实验，确定不同细胞类型和 RNA 用量下的最佳转染时间和剂量。在实验过程中，严格按照优化后的条件进行操作，并设置合适的对照组，以确保实验结果的准确性和可靠性。

2. 采用合适的转染方法：除了常规的脂质体转染、聚合物转染和病毒载体转染外，还可以结合其他技术，如电穿孔法、基因枪法等，提高 RNA 转染效率。例如，电穿孔法适用于一些对传统转染方法不敏感的细胞，但需要注意优化电穿孔参数，以避免对细胞造成过大的损伤。

四、前沿技术在提高 RNA 转染效率中的应用

（一）纳米技术

1. 纳米颗粒介导的转染：纳米颗粒作为一种新型的转染载体，具有良好的生物相容性、高负载能力和靶向性。通过修饰纳米颗粒表面的化学基团，可以增强其与 RNA 的结合能力和细胞摄取效率。例如，使用脂质 - 聚合物杂化纳米颗粒，能够将 RNA 高效递送至细胞内，并实现可控的基因表达。

2. 基于纳米材料的转染试剂：一些新型的纳米材料如碳纳米管、金纳米颗粒等被应用于转染试剂的开发。这些纳米材料具有独特的物理和化学性质，能够与 RNA 形成稳定的复合物，并通过多种机制促进细胞摄取和基因表达。同时，纳米材料还可以作为载体，携带其他生物活性分子，如药物、抗体等，实现联合治疗和多功能基因调控。

（二）基因编辑技术辅助的 RNA 转染

1. CRISPR - Cas 系统：利用 CRISPR - Cas 系统对细胞内的基因进行编辑，可以改变细胞的特性，提高其对 RNA 转染的敏感性。例如，通过敲除或抑制某些与 RNA 降解或免疫反应相关的基因，可以增强细胞内 RNA 的稳定性和表达水平。此外，还可以利用 CRISPR - Cas 系统将 RNA 转染靶向特定的基因组区域，实现精准的基因调控。

2. 基因编辑与转染的联合应用：将基因编辑技术与 RNA 转染相结合，为疾病治疗和基因功能研究提供了新的策略。例如，先通过基因编辑修复或改造细胞内的致病基因，然后再进行 RNA 转染，导入治疗性基因或调控因子，以实现疾病的治疗和细胞功能的恢复。这种联合应用需要精确的实验设计和操作，以确保基因编辑和 RNA 转染的协同效果。

五、结论