荧光光谱应用 | 405nm激光诱导荧光检测系统的研制及其用于皮肤癌诊断的初步实验研究

ＸＬ５０小鼠皮肤鳞癌细胞系是合作课题组在前期建立的紫外诱发的ＳＫＨ－１小鼠皮肤鳞癌模型基础上分离建立，保藏在中国典型培养物保藏中心（编号为ＣＣＴＣＣＮｏ：Ｃ２０１８２７）。ＳＫＨ－１无毛小鼠，６～８周龄的雌性小鼠，体重约２０ｇ，引进自美国ＪＡＫ－ＳＯＮ实验室，繁育于上海市公共卫生中心实验动物部（实验动物许可证号：ＳＣＸＫ（沪）２０１５－０００２），饲养于同济大学医学院光医学研究所的清洁级动物中心，室温２０～２５℃，相对湿度５５％，予以标准灭菌饲料和饮用水饲养。

随机选择６只正常雌性ＳＫＨ－１无毛小鼠，分别用小鼠皮肤鳞癌ＸＬ５０细胞皮下进行小鼠皮肤鳞状细胞癌种植瘤模型造模，当瘤体直径增长至６～８ｍｍ时，取小鼠肿瘤及正常皮肤行组织病理学检查。将小鼠分成三组，每组两只，使用浓度分别为２％、４％和８％５－ＡＬＡ处理瘤体及对侧的正常皮肤组织。随后对小鼠分别于敷药前、敷药后１ｈ、敷药后３ｈ及３ｈ后经６３０ｎｍ红光（剂量为

１００ｍＷ／ｃｍ2，６ｍｉｎ）照光后，使用４０５ｎｍ激光诱导荧光检测仪对其荧光分别进行检测，同一检测区均随机取３个点，对３个点的数据进行平均后，分析其荧光光谱。

首先对皮肤鳞状细胞癌小鼠模型进行了组织病理学分析，其检查结果如图1所示。病理检查显示小鼠鳞癌种植瘤模型中几乎整个肿瘤组织均为非典型鳞状细胞，细胞异型性明显，胞质较少，胞质嗜伊红，核大深染，胞核大小及染色深浅不一，可见不典型分裂相、双核或多核瘤巨细胞；损害侵袭表皮，表现为病变部位表皮细胞出现不典型增生，排列紊乱；组织内可见角化不全和角化不良细胞，局部可见细胞间桥结构。病理分析结果证实本实验所构建的肿瘤小鼠模型为小鼠鳞状细胞癌。

图1 不同放大倍率下的小鼠正常皮肤与鳞癌种植瘤病理结果（Ｈ＆Ｅ染色）（ａ）癌变小鼠（ｂ）正常小鼠

图2为ＰｐＩＸ标准品由４０５ｎｍ激光诱导的的荧光光谱曲线，其主特征发射峰峰值在６２０．５０５ｎｍ，次特征发射峰峰值为６８０．６６ｎｍ。图3为在正常皮肤和鳞癌种植瘤区域，分别于敷浓度２％的５－ALA前，敷５－ALAALA三小时后，以及经６３０ｎｍ红光临床光动力治疗后采集到的荧光光谱，从比较结果可以看出敷ALA前，小鼠正常皮肤及鳞癌种植瘤区域均未检测到任何特征发射峰，敷ALA后正常皮肤及鳞癌种植瘤区域均可以在６３５．１４４ｎｍ处检测到一个特征发射峰，但是只有３ｈ后才可在６９５ｎｍ附近检测到一个比较明显的次峰。经６３０ｎｍ红光临床光动力治疗后（剂量为１００ｍＷ／ｃｍ２，６ｍｉｎ），６３５ｎｍ的特征峰强度明显减弱，可证实通过外源性ALA转换的ＰｐＩＸ的特征发射峰在６３５ｎｍ处。与ＰｐＩＸ标准品相比，其特征发射峰峰值发生了红移。图4为敷不同浓度的ALA３ｈ后，小鼠的正常皮肤和鳞癌种植瘤区域的荧光光谱，从比较结果可以看出敷ALA后小鼠鳞癌种植瘤区域在６３５ｎｍ附近的特征发射峰峰值强度明显高于正常区域。

图2 PPIX标准品的荧光光谱曲线

图3 敷２％浓度的ALA鳞癌小鼠在不同时间点（敷药前、敷药３ｈ及630nm红光光照后）的正常皮肤和鳞癌种植瘤区域荧光光谱

图4 敷不同浓度的ALA 3h后正常皮肤与鳞癌种植瘤区域的荧光光谱

激光诱导荧光技术具有无损性、快捷性以及实时性的检测优势，在癌症的早期诊断中具有非常好的应用前景。本实验证实利用405nm的激光诱导荧光技术进行皮肤癌诊断时，可以用上海如海光电LIFS405激光诱导荧光光谱仪肿瘤组织和正常组织的外源ALA-PPIX的荧光强度具有显著的差异性，是一较好的识别参数，利用此参数可对人体的肿瘤组织和正常组织进行定性鉴别，为快速诊断皮肤癌起到积极的辅助作用。但是如需跟踪皮肤癌的发展态势和对治疗效果进行评估，必须进一步通过实验获取ALA的最佳剂量和最佳作用时间，实现对荧光光谱强度的标定，以荧光强度的变化作判据来诊断。

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