用SPAD23在共聚焦显微镜中实现波动对比度的超分辨率

用SPAD 23在共聚焦显微镜中实现波动对比度的超分辨率

在过去的 20 年里，远场光学显微镜已经跨越了以阿贝衍射极限为代表的一度难以逾越的分辨率障碍 ，开发多种成功的方法，如受激发射损耗(STED) 、单分子定位方法(PALM 和 STORM) ，结构照明显微术(SIM)和超分辨率光学波动成像(SOFI)，这要归功于图像传感器技术的改进以及单分子光谱学的巨大进步。

在这里，我们提出了一种新的显微技术，它利用 SPAD23阵列探测器的超高时间分辨率来测量荧光波动引起的相关性。在 ISM 架构中测量的这种相关性，然后被用作具有高达 4倍增强横向分辨率和增强轴向分辨率的超分辨率图像的对比度。仅用几毫秒的像素驻留时间就可以获得高信噪比的超分辨率图像。

单光子探测器阵列SPAD23技术源于代尔夫特理工大学和洛桑联邦理工学院 7 年的研究工作和 6 项独特技术。它是由23个六角形封装的单光子雪崩二极管组成的探测器阵列(SPADs)，具有更高的灵敏度和更低的噪声。这款单光子探测器阵列SPAD23在其宽探测谱段内拥有>50%的探测效率，<100cps的暗计数水平，且因其独特的半导体工艺及设计实现了前所未有的填充因子＞80%。这款带有时间标记功能（Time Tagging）的SPAD23整体尺寸只有磁卡大小，是荧光显微和量子信息领域的理想探测工具。

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得益于SPAD23单光子阵列探测器的优异性能，在与共聚焦显微镜搭配使用的过程中，增加了光的收集，Z终获得了更清晰、更明亮的图像，其中还包含有关潜在分子功能、相互作用和环境的功能信息。

下图提出了一种超分辨光学起伏图像扫描显微术的方案；设置在标准共焦显微镜的图像平面中的针孔和单像素检测器被替换为 23 像素的 SPAD 阵列，SPAD23单光子阵列探测器，增加了光线收集，提高了成像速度，减少了背景噪音，能够在共聚焦显微镜中实现波动对比度的超分辨率。

当扫描样品台时，每个光子的检测时间记录在相连的 FPGA 电路中，并以数字形式存储。然后分析该数据，为阵列中的每个像素对产生第二个相关图像，产生 232 个分辨率增强为 2 的相关图像。如下图b所示分辨率的提高可归因于两个因素。首先，如在 ISM 中一样，每个小探测器的点扩展函数(PSF)是激发和其探测 PSF 的乘积。此外，从两个这样的 ISM PSFs 相乘得到的相关对比度实现了进一步的变窄。在对图像进行适当的移动以使其相互重叠之后，这一过程被称为像素重新分配，我们在空间频率域中应用傅立叶重新加权滤波的Z后阶段。理论上，Z终 SOFISM 图像的 PSF 具有超过衍射极限 4 倍的横向分辨率增强。

图C 展示了 SOFISM，对相对稀疏的单个 CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳量子点(QDs)的样品进行成像。除了由于衍射造成的模糊之外，标准的共焦图像(CLSM)包含大量的噪声，这是由于量子点的发射强度在亮和暗状态(闪烁)之间的波动造成的。生成标准 ISM 图像的分辨率提高了 2 倍，同时噪声水平明显降低，通过像素重新分配达到平均水平。或者，通过计算荧光信号的二阶相关矩阵，然后重复 ISM 过程的剩余部分(像素重新分配和傅立叶重新加权),产生分辨率提高 2.5 倍的更清晰的图像。我们注意到，这个数字低于理论预测的数字，可能是由于探测器的有限尺寸、样品振动和其他技术方面的原因。

Z后，还可以生成互相关阶数高于 2 的 SOFISM 图像；上图C 展示了来自相同场景的 4 阶相关图像，产生横向分辨率的 4倍增 强。 在类似的实验条件下，尽管检测方案有些麻烦，SOFISM 已经被证明在轴向分辨率上提供了 2 倍的改进，虽然一些成熟的超分辨率技术已经被生命科学研究团体采用并取得了巨大成功，但是 SPAD 阵列技术的Z新进展为可以针对特定需求提供超分辨率解决方案。SOFISM 可以提供一种实验上简单的方法，在合理的曝光时间内提供显著的 3D 分辨率增强，并且没有显著的实验复杂性。

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