SPAD阵列在共聚焦显微镜中的超分辨率成像应用——基于波动对比度的SOFISM方法

SPAD阵列在中的超分辨率成像应用——基于波动对比度的SOFISM方法

随着成像技术的不断进步，许多微观世界的奥妙被人类不断的发现和记录下来，成为科技进步的重要研究工具。但是传统远场光学显微镜受到“阿贝极限”的限制，在上存在天然瓶颈，导致很多领域的研究受到了阻碍。近年来，虽然有如STED、PALM、STORM等超分辨率显微技术不断成熟，但这些方法对设备配置和操作要求较高，实验复杂性大，价格昂贵，难以满足当今快速发展的科学研究。

相比之下，一种被称为图像扫描显微技术（Image Scanning Microscopy, ISM）的方法正在受到关注。该方法仅需替换探测器并更改成像分析方案，便可实现分辨率与的提升，具备较强的实用性。

为进一步突破成像分辨率，同时保持系统的简洁性，研究人员将雪崩二极管阵列（SPAD array）与ISM方法结合，提出了一种新型超分辨率成像方案——SOFISM（Super-resolution Optical Fluctuation Image Scanning Microscopy）。本文也是针对此方法，做了一些原理方面的论述，同时讲述了一些研究成果和应用方向，欢迎大家来电讨论沟通。

技术原理与系统构成

1.   SOFISM的工作原理

该技术在传统共聚焦显微镜的基础上，进行如下改造：

1. - 用23像素的阵列SPAD替代共聚焦中的点探测器

2. - 每当激光扫描样本时，SPAD阵列会记录下每个像素检测到的光子到达时间

3. - 系统将阵列中任意两个像素组合，计算其二阶或更高阶相关函数

4. - 相关函数用于重建图像，可有效增强对比度并提升分辨率

SOFISM的效果，主要来自两个方面：

1. - 单个SPAD像素的（PSF）变窄（提升√2倍分辨率）

2. - 不同像素之间的相关计算进一步提升分辨率（最终可达4倍）

2.  SPAD阵列的优势

SPAD阵列是一种基于cmos工艺制造的，具备以下突出特点：

1. - 可实现单光子探测且内置了tdc

2. - 具备20ps的时间分辨率

3. - 能实时的快速数据采集和传输

4. - 阵列化布局可拓展为高分辨率图像传感实验验证与成像效果

研究团队采用了CdSe/CdS/ZnS核壳结构的样本进行实测。

分别获得了以下图像结果：

1. - CLSM图像：普通共聚焦图像，存在明显的模糊与噪声

2. - ISM图像：清晰度提升至原来的2倍，噪声降低

3. - SOFISM（二阶相关）：分辨率提升至约2.5倍

4. - SOFISM（四阶相关）：分辨率理论上可达原始图像的4倍

在整个过程中，每个像素仅需几毫秒的驻留时间，即可完成高信噪比图像采集，非常适合动态样本或弱场景的测量需求。

系统核心配置

系统关键核心硬件如下：

1. - 光源：标准共聚焦激光扫描器

2. - 探测器：单光子阵列探测器

本次实验所使用的单光子阵列探测器—SPAD23，它之所以非常适合应用于SOFISM超分辨率显微成像系统，主要是因为它的多个核心特性正好匹配该成像方案的技术需求与成像逻辑。其优势如下：

单光子灵敏度

SOFISM依赖荧光信号中的微弱强度波动，这些波动往往涉及单光子级别的统计变化。SPAD23具备真正的单光子探测能力，可以高效微弱的荧光闪烁事件，为后续的相关性计算提供了高SNR的输入数据。

PS级时间分辨率（20ps）

SOFISM的核心是对荧光发射过程中的时间相关性进行计算。SPAD23每个像素都集成了一个20 ps分辨率的TDC（时间数字转换器），可实时记录光子到达时间，为高阶相关函数（如二阶、四阶）提供数据，基础SOFISM中越高阶的相关函数越需要时间分辨率高，SPAD23的10ps Bin宽和20ps的时间戳精度可以提供有力的支撑。

阵列结构支持多像素关联计算

SOFISM通过多个像素之间的协同工作进行图像重建。SPAD23采用六边形排列的23像素阵列结构，不仅提升了范围，还允许计算23个像素对的时间相关性，这对于图像分辨率增强至关重要。SOFISM计算跨像素相关性，SPAD23提供了充足的像素数量和布局密度，确保成像精度和算法稳定性。

高填充因子和光子收集能力

SOFISM需要快速、高信噪比成像，SPAD23的像素填充因子超过80%，单像素尺寸为23μm，达1.3mm×1.3mm，有效提升了光子收集效率。这对于弱荧光样本尤为重要，可减少时间与激发强度。SPAD23的高光敏设计极大优化成像效率。

互不干扰的独立工作机制

SOFISM成像中每个像素都承担独立信号通道的角色。SPAD23的每个SPAD + TDC模块彼此互不影响死时间，可以实现并行、高效的数据采集，避免了光子堆积导致的信息丢失。

紧凑集成的体积设计

传统的SPAD + 多通道TDC系统通常庞大而复杂，而SPAD 23将所有探测器与时间采集电路集成在一块微型模块上，体积仅为半部手机大小，非常适合放置于现有共聚焦系统的成像面上。

应用优势

高分辨率、高对比度

1. - 在不引入额外复杂光学路径的前提下，实现2-4倍分辨率提升，SPAD 93的问世，可以更进一步的提高分辨率

2. - 有效yi制荧光闪烁带来的

简单易用、集成度高

1. - 不需调整光路或添加特殊探测模块

2. - 结合SPAD的高速响应，可兼容高速活体成像

适配性强、兼容主流共聚焦平台

1. - 可作为传统共聚焦系统的升级模块

2. - 特别适用于高时间分辨、低光照、活细胞荧光研究

SOFISM方法结合SPAD阵列的时间灵敏性与图像扫描显微的结构优势，为生物显微成像提供了一种“低成本 + 高性能”的超分辨解决方案

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