蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是一种常用于蛋白质分析的技术手段，其核心流程包括通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品进行分离，随后将蛋白转移至固相膜上，并利用特异性抗体（通常为一抗与二抗的复合物）对目标蛋白进行检测。该方法因其高灵敏度和良好的特异性，已成为生命科学研究中应用最广泛的蛋白检测技术之一。在WB实验中，蛋白样品的制备是至关重要的第一步，其质量直接影响后续实验的可靠性和重复性。
蛋白提取的核心在于最大限度地保持目标蛋白的完整性，防止其在提取过程中发生降解。因此，整个操作应在低温条件下进行，并尽量缩短处理时间。此外，针对不同来源的样本（如组织或细胞），需根据其特性选择合适的裂解液和提取方法。
在进行蛋白提取前，研究人员应对目标蛋白的基本信息有充分了解，包括其表达水平、亚细胞定位、分子量范围，以及是否存在可变剪接或翻译后修饰等。这些信息不仅有助于优化蛋白提取策略，还能为后续选择内参蛋白、调整电泳和转膜条件提供依据。
常用裂解液介绍
选择合适的裂解液也是蛋白提取过程中的一个关键步骤。裂解液通常包含缓冲系统、盐离子、表面活性剂和蛋白酶抑制剂等组分，它们各自发挥着不同的作用，共同影响着蛋白提取的效果。因此，在选择裂解液时，我们需要根据目标蛋白的特性以及实验需求进行综合考虑。
特定用途（如质谱检测，需避免AEBSF导致的质谱峰漂移。NO检测，需避免蛋白酶和磷酸酶抑制剂的影响）需要自行添加特定抑制剂或不需要添加抑制剂时，可以考虑选购20119ES或20120ES。
常见的裂解液除了其中的有效裂解成分以外，还含有比较复杂的缓冲体系。以常见的RIPA裂解液成分为例：Tris-HCl是常见的缓冲体系之一，为蛋白提供稳定的环境(7.4是接近生理状态的PH值)；接近生理状态浓度的NaCl有利于保持蛋白的溶解状态，不会破坏蛋白及蛋白间的相互作用；少量的EDTA可以螯合金属离子抑制蛋白酶活性；SDS是一种裂解能力很强的阴离子表面活性剂，高浓度的SDS会破坏蛋白的天然构象使其变性，溶液中盐离子强度越强，SDS的破坏作用越强；Sodium deoxycholate(脱氧胆酸钠)是一种阴离子表面活性剂，作用较SDS弱；Triton X-100是一种非离子型表面活性剂不会使蛋白变性，也不会破坏蛋白与蛋白之间的相互作用，但可破坏蛋白质与脂质之间的相互作用。
常见酶抑制剂介绍
此外，选择裂解液时还需考虑其对膜蛋白、胞浆蛋白和核蛋白的提取效果，以及是否含有蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂。同时，不同物种的样品兼容性也是选择裂解液时需要考虑的因素。
蛋白提取注意事项
防止蛋白降解：在蛋白提取过程中，应尽量避免样品暴露于蛋白酶活性较高的温度环境。对于来源于哺乳动物的组织或细胞样本，整个制备流程需在低温条件下进行，以最大限度抑制蛋白酶的活性，防止目标蛋白被降解。
组织采集顺序与处理建议：取样时应遵循一定的顺序，优先处理消化腺相关组织（如肝脏、胰腺）及消化道器官（如胃、小肠、大肠），以及富含免疫细胞的组织（如肺）。随后再采集生殖系统组织（如卵巢、子宫、睾丸），最后处理心脏、脾脏、肾脏和脑等器官。若组织不能立即用于实验，应迅速置于液氮中冷冻或转移至?80°C保存。需特别强调的是，尽量使用新鲜组织进行蛋白提取，尤其是消化系统来源的样本，因其在WB检测中通常信号更强、背景更低。若样品经历反复冻融，应弃用，以免影响实验结果。
细胞样本处理注意事项：某些细胞系内源性蛋白酶活性较高，提取时应尽量缩短操作时间，并可选用含高浓度SDS的裂解液，以加快裂解过程并抑制酶活性。
胰蛋白酶对膜蛋白提取的影响：若实验目标为膜蛋白，需警惕胰蛋白酶可能引起的蛋白剪切效应。在细胞传代过程中，胰酶处理可能导致膜蛋白被切割，从而在WB中出现非特异性条带或信号缺失。因此，建议最后一次传代时控制细胞密度，给予细胞充分时间恢复膜蛋白表达。收集贴壁细胞时，推荐采用直接裂解后刮取的方式，或先刮取细胞再进行裂解，尽量避免使用胰酶消化步骤。
减少杂质干扰：
蛋白提取物中常含有杂质，这些杂质会影响后期电泳分离的效果。为了优化这一步骤，可以采取以下措施：
翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
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