细胞激活剂──钙离子载体离子霉素Ionomycin＆佛波肉荳蔻醋酸PMA

离子霉素(Ionomycin)，一种来源于Streptomyces conglobatus的聚醚类窄谱抗生素，是一种有效的钙离子载体，高度选择性结合钙离子，也能转运其他离子，但亲和力相对较低(Ca²⁺ >Mg²⁺ >>Sr²⁺=Ba²⁺)。Ionomycin通过直接刺激钙池调控钙内流，提高胞内钙离子水平。Ionomycin常用的有效浓度为：1-10 μM。

图1.离子霉素游离酸分子结构式(CAS NO: 56092-82-0)

 图2.离子霉素钙盐分子结构式(CAS NO: 56092-82-1)

Phorbol 12-myristate 13-acetate（佛波肉豆蔻醋酸），简称为PMA，一种广泛用于体内外实验的佛波酯(phorbol ester )类PKC激活剂，PMA可抑制Fas诱导的细胞凋亡，同时又可诱导HL-60细胞的周亡发生。PMA是一种强效的肿瘤促进剂能够诱导小鼠皮肤瘤生成。常常与离子霉素Ionomycin联合刺激多种免疫细胞，以产生细胞因子。同时也与蛋白转运抑制剂如布雷非德菌素A (Brefeldin A)、莫能霉素(Monensin)联合使用抑制细胞因子外分泌，保留在细胞内以准确分析细胞因子表达水平。PMA推荐使用浓度为0.1-10 μM。

图3.PMA分子结构式(CAS NO: 16561-29-8)

在细胞内，Protein kinase C (PKC)的激活，可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致多种蛋白的表达，进而引起细胞的活化。PKC可以在DAG(二脂酰甘油)和Ca²⁺共同作用下被激活。Ionomycin常与PKC激活剂PMA联用，刺激免疫细胞活化，同时也加入蛋白转运抑制剂（通常是Monensin或Brefeldin A）阻止高尔基体将新分泌蛋白运输到细胞外，以增强细胞内细胞因子的检测。如果是对分泌蛋白进行免疫检测（例如 ELISA、蛋白免疫印迹或多重蛋白检测），则无需使用Monensin或Brefeldin A对细胞进行处理。

1、试剂准备

① Ionomycin, 0.5 mg/mL用纯乙醇配制。分装为20 μL/管，–20°C可保存6个月。

② Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)，0.1 mg/mL用DMSO配制。分装为20 μL/管，–20°C保存6个月。

2、无菌条件下从健康人的外周血中分离PBMC

① 用无菌PBS按照1：1稀释全血；

② 加入等体积的Ficoll-Paque，室温下400× g离心20-30 min；

③ 收集交界处的PBMC，加入无菌PBS，4°C下300× g 离心5 min，丢弃上清液，重复两次洗涤细胞；

④ 加入RPMI 1640完全培养基重悬细胞，继续培养；

3、PMA/Ionomycin刺激细胞

收集细胞计数，用新鲜培养基重悬至细胞密度为1~2×10⁶ cells/mL，加入PMA (10 ng/mL)和Ionomycin (1 μg/mL)混匀，37 ℃ 5% CO₂培养4~6 h（不要超过6 h）

注：根据实验需求，选择是否需要加入蛋白转运抑制剂Monensin或Brefeldin A。

4、4°C下300× g 离心5 min，去除上清，收集细胞进行流式细胞染色，检测细胞因子表达情况（如IFN-γ、IL-2、TNF-α等）。