扫描电镜观察细胞样品

　　扫描电镜是自上世纪60年代作为商用电镜面世以来迅速发展起来的一种新型的电子光学仪器，被广泛地应用于化学、生物、医学、冶金、材料、半导体制造、微电路检查等各个研究领域和工业部门。

扫描电镜样品处理方法

　　单固定半程序微波辐射法：

　　微波辐射可应用于扫描电镜细胞样品的制备。处理培养细胞的过程是先将一直径为15cm、内盛200ml水的培养皿置于微波炉内，先用低档微波辐射8min预热，用温度计测水温，起始温度约为20℃，使终止温度为30±5℃。如果温度超过35℃，则加冷水降温。随后将装有样品和浸泡液的小瓶放于培养皿内，再继续用微波处理2min，并使样品保持在35℃环境中。除干燥外，固定、脱水、置换均在炉内进行。

　　具体步骤为：①前固定：在装有样品的小瓶中加入适量的2.5%的戊二醛，一般为样品的10倍。微波辐射5min，炉外原液停留30min。②漂洗：每次微波辐射2min，炉外原液停留5min。③脱水：乙醇逐级脱水，依次为：50%，70%，90%，1**%。每次微波辐射2min，炉外原液停留5min。④置换：纯乙酸异戊酯溶液置换三次，每次微波辐射2min，炉外原液停留5min。⑤干燥：CO2临界点干燥。

　　该方法对于贴壁培养的细胞较适用。在游离细胞超快扫描电镜样品制备中，还有另一种方案。在制备高等植物的扫描电镜样品时，建立了全程序微波辐射法，其方法与上述方法不同之处在于植物样品的干燥也是借助微波，利用微波炉解冻档，起始温度为60℃，终止温度70±3℃，干燥3~4min。

　　单固定氯化金染色法：

　　对生物样品而言，氯化金有良好的导电性，但没有固定作用，使其在扫描电镜样品制备中的应用受到限制。但利用氯化金代替锇酸，制备扫描电镜和透射电镜样品，观察结果显示其图像质量符合要求。用氯化金替代锇酸，对贴壁培养的细胞进行制样。

　　具体步骤为：①固定：2.5%戊二醛固定2h。②前漂洗：0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗二次，每次10min。③后漂洗：双蒸水漂洗3次，每次10min。④浸渍染色：2%氯化金两次，每次1.5h。⑤前漂洗：0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗2次，每次10min。⑥后漂洗：双蒸水漂洗3次，每次10min。⑦脱水：乙醇逐级脱水，依次为50%，70%，90%，1**%，1**%，每次10min。⑧置换：纯乙酸异戊酯置换20min或过夜。⑨干燥：CO2临界点干燥。

　　单固定快速脱水法：

　　操作程序为：①固定：2.5%戊二醛固定30min。②脱水：乙醇逐级脱水，依次为：70%，90%，1**%，1**%，每次5min;③置换：纯乙酸异戊酯置换5min;④干燥：CO2临界点干燥。对于不同的样品要采用合适的方法，才能得到理想的效果。

扫描电镜细胞样品观察步骤

　　1、取材

　　扫描电镜下观察的样品尺寸要求比较宽松，一般1cm3左右样品都能适合大多数扫描电镜观察。

　　2、固定

　　铺片培养的细胞取出浸入PBS中，漂洗细胞表面。然后将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的3%戊二醛，在4℃固定2h或过夜，吸出固定剂，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃预冷的1%锇酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。

　　3、脱水

　　丙酮/醋酸异戊酯(1：1)脱水10min，接下来醋酸异戊酯脱水30min，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、1**%)脱水，每种浓度酒精通过2次，每次15min。

　　4、干燥

　　以临界干燥法Z理想，但必须要有专门的仪器临界点干燥器。当实验室不具备此种仪器时，可采用冰冻干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的关键是乙腈置换。样品经上述处理后，浸入520%的乙腈溶液中，然后依次更换70%、80%、90%、95%、1**%的乙腈溶液，每次浸泡15-20min，Z后再换1**%乙腈。然后进行真空干燥。即将乙腈置换后的样品连同青霉素瓶一起放到真空镀膜台的真空装置内，抽低真空，一般需30-50min。样品干燥后，待其温度升至室温时再放气，取出样品。

　　5、样品导电处理

　　用真空喷镀法。所用的仪器为真空喷镀仪，扫描电镜样品被安置在离蒸发源约10-15cm处的样品台上，样品进行旋转活动，先喷碳。后喷金，喷镀应均匀，完成后镜下观察。