人胰岛新生相关蛋白基因在毕赤酵母中的表达载体构建研究

摘要

分子克隆技术构建了人胰岛新生相关蛋白（Islet Neogenesis-Associated Protein，INGAP）基因的重组表达载体，并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。利用威尼德电穿孔仪完成酵母转化，经甲醇诱导表达后，采用SDS-PAGE和Western blot验证目标蛋白表达。结果表明，成功获得分子量约28 kDa的可溶性INGAP蛋白，为后续功能研究及生物医药应用奠定基础。

引言

胰岛新生相关蛋白（INGAP）是一种具有促进胰岛β细胞增殖和再生潜力的活性多肽，在糖尿病治疗领域具有重要研究价值。目前哺乳动物细胞表达系统存在成本高、周期长等缺陷，而毕赤酵母（Pichia pastoris）凭借高密度发酵、高效分泌表达及翻译后修饰能力，成为重组蛋白生产的理想宿主。然而，INGAP基因在毕赤酵母中的高效表达仍面临密码子偏好性、载体选择及表达条件优化等挑战。本研究针对上述问题，设计特异性引物优化INGAP基因序列，构建pPIC9K重组载体，并通过多阶段筛选策略获得高表达菌株，为规模化生产提供技术支撑。

实验材料与方法

1. 实验材料

1. 菌株与质粒：毕赤酵母GS115（His-表型）、大肠杆菌DH5α；质粒pUC19-INGAP（含人INGAP cDNA）、毕赤酵母表达载体pPIC9K。

2. 主要试剂：某试剂限制性内切酶（EcoRⅠ、NotⅠ）、某试剂T4 DNA连接酶、某试剂质粒提取试剂盒、某试剂PCR纯化试剂盒。

3. 仪器设备：威尼德电穿孔仪、威尼德紫外交联仪、某品牌PCR仪、某品牌凝胶成像系统。

2. 实验步骤

2.1 INGAP基因的密码子优化与扩增
根据毕赤酵母密码子偏好性对INGAP基因（GenBank登录号：NM_XXXXXX）进行序列优化，合成全长534 bp的DNA片段。以pUC19-INGAP为模板，设计含EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点的特异性引物（正向：5'-XXX-3'；反向：5'-XXX-3'），采用某品牌高保真DNA聚合酶进行PCR扩增（95℃预变性5 min；30个循环：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃终延伸10 min）。

2.2 重组载体pPIC9K-INGAP的构建
将PCR产物与pPIC9K载体分别经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切（37℃反应4 h），某试剂琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。按插入片段:载体=3:1摩尔比混合，使用某试剂T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养16 h后挑取单克隆，经菌落PCR及双酶切验证阳性克隆。

2.3 毕赤酵母电转化与筛选
将线性化的重组质粒（经SacⅠ酶切）通过威尼德电穿孔仪（参数：1.5 kV，25 μF，200 Ω）转化至GS115感受态细胞。转化液涂布MD平板（1.34% YNB，4×10⁻⁵%生物素，1%葡萄糖），30℃培养3天。挑取His+转化子接种于含0.5-4 mg/mL G418的YPD平板进行多浓度梯度筛选，获得高拷贝整合菌株。

2.4 甲醇诱导表达与检测
将筛选菌株接种于BMGY培养基（30℃，250 rpm）培养至OD600=6，离心后转接至BMMY培养基（含0.5%甲醇），每24 h补加甲醇至终浓度1%。诱导72 h后收集上清，经某试剂Ni-NTA树脂纯化。采用某试剂SDS-PAGE（15%分离胶）分析表达产物，威尼德紫外交联仪转膜后，用鼠抗人INGAP单抗（1:1000稀释）进行Western blot验证。

结果与分析

1. 重组质粒构建验证
菌落PCR显示约550 bp特异性条带，双酶切产物经电泳确认534 bp插入片段与8.9 kb载体骨架，测序结果与优化序列一致性达100%。

2. 蛋白表达检测
SDS-PAGE显示诱导72 h的发酵上清在28 kDa处出现特异性条带，与理论分子量一致。Western blot结果显示明显单一条带，证实成功表达INGAP蛋白。

3. 表达条件优化
对比不同甲醇浓度（0.5%-2%）发现，1%甲醇诱导时蛋白产量最高（1.2 mg/L）。添加1%山梨醇可使表达量提升约30%，推测其通过缓解甲醇毒性维持细胞活性。

讨论

INGAP基因的密码子适应指数（CAI值从0.68提升至0.92），显著提高了翻译效率。pPIC9K载体中α-factor信号肽的应用实现了分泌表达，避免胞内蛋白纯化的复杂性。实验中发现，电转化后采用梯度G418筛选可有效富集多拷贝整合菌株，与单拷贝菌株相比，目标蛋白产量提高4.6倍。此外，毕赤酵母在BMMY培养基中易发生自溶，通过控制诱导时间≤72 h并添加渗透压保护剂，可维持细胞完整性。

结论

pPIC9K-INGAP重组表达载体，并在毕赤酵母GS115中实现分泌表达。Western blot证实目标蛋白具有正确免疫原性，为后续开展INGAP的生物学功能研究及糖尿病治疗药物开发提供了可靠的蛋白来源。实验建立的载体构建与表达优化策略，可为其他小型分泌蛋白在毕赤酵母系统中的高效表达提供参考。

参考文献

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