猪流行性腹泻病毒M基因片段原核表达效析

摘要

本研究针对猪流行性腹泻病毒（PEDV）M 基因片段开展原核表达研究。通过 RT-PCR 扩增目的片段，构建 pET-32a 重组载体，借助威尼德 Gene Pulser 630 指数衰减波电穿孔仪优化大肠杆菌 Rosetta (DE3) 转化条件，实现 M 蛋白高效可溶性表达，为 PEDV 诊断抗原制备及疫苗研发提供关键技术支撑。

引言

猪流行性腹泻（PED）是由 PEDV 引发的急性肠道传染病，严重危害全世界养猪业。病毒膜蛋白（M 蛋白）作为病毒结构的核心组分，其原核表达产物在病毒检测试剂开发及亚单位疫苗研究中具有重要价值。然而，传统电转化方法存在效率低、细胞损伤大等问题，难以满足高活性外源蛋白表达需求。威尼德 Gene Pulser 630 指数衰减波电穿孔仪作为新一代高压脉冲电穿孔技术标杆，凭借智能指数衰减波形与多维度参数控制，突破了传统转化效率瓶颈，为生物大分子递送提供了精准解决方案。本研究旨在通过克隆 PEDV M 基因片段并优化表达体系，探索该仪器在病毒基因工程领域的实际应用潜力，为兽用生物制品研发提供高效技术路径。

材料与方法

实验材料

PEDV CH-HB2017 株病毒液由本实验室保存，大肠杆菌 DH5α 用于载体构建，Rosetta (DE3) 作为表达宿主。pET-32a (+) 载体、RNA 提取试剂盒、反转录酶、高保真 DNA 聚合酶、限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I、DNA 连接酶等均采用某试剂。威尼德 Gene Pulser 630 指数衰减波电穿孔仪配备 0.1cm 电击杯，用于重组质粒转化操作。

实验方法

1. 病毒 RNA 提取与 cDNA 合成

取 100μL PEDV 病毒液，按照 RNA 提取试剂盒说明书操作，经酚氯仿抽提和乙醇沉淀后，用 DEPC 水溶解 RNA。通过 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，利用 NanoDrop 测定浓度，确保 A260/A280 比值在 2.0±0.1 范围内。取 2μg 总 RNA，借助反转录酶及随机引物合成 cDNA 第一链，反应条件为：25℃孵育 10min，42℃延伸 60min，70℃灭活 15min，产物于 - 80℃保存备用。

2. M 基因片段克隆与载体构建

依据 GenBank 中 PEDV M 基因序列（登录号：MN654321）设计特异性引物，引入 EcoR I 和 Xho I 酶切位点。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应程序为：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 40s，共 35 个循环；最后 72℃终延伸 10min。扩增产物经胶回收纯化后，与经相同酶切的 pET-32a 载体于 16℃连接过夜，获得重组质粒 pET-32a-M。

3. 感受态细胞制备与电转化前处理

将 Rosetta (DE3) 接种于 LB 培养基，37℃振荡培养至 OD₆₀₀为 0.6-0.8，冰浴 30min 后于 4℃、6000rpm 离心 10min 收集菌体。用预冷的无菌水洗涤菌体 3 次，每次离心后弃去上清，最终用 10% 甘油重悬菌体至浓度约 5×10¹⁰ CFU/mL，分装于预冷离心管中，置于冰上备用。

4. 威尼德电穿孔仪转化操作

取 50μL 感受态细胞与 1μL 重组质粒（浓度 1μg/μL）轻柔混匀，转移至 0.1cm 电击杯中。将电击杯放入威尼德 Gene Pulser 630 指数衰减波电穿孔仪，选用仪器内置的原核细胞预优化程序。该程序通过智能阻抗检测技术，实时测量样品电阻并动态调整脉冲参数，确保每次电击条件精准匹配细胞状态。点击启动后，仪器释放高强度指数衰减波脉冲，瞬时作用于细胞，10 英寸触控大屏同步显示脉冲波形及电压、时长等参数变化，实现实验过程全程可视化。脉冲结束后，立即加入 950μL 预热的 LB 培养基，37℃振荡复苏 1.5h，将菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的 LB 平板，37℃培养 14h 筛选阳性克隆。

5. 重组蛋白诱导表达与优化

挑取单菌落接种于 5mL 含抗生素的 LB 培养基，37℃培养至 OD₆₀₀为 0.8，按 1:100 转接至 100mL 新鲜培养基。待菌体生长至对数中期，分别加入 IPTG 至终浓度 0.2、0.5、1.0mM，设置诱导温度 20℃、28℃、37℃，诱导时间 4-8h。收集菌体进行超声破碎（功率 200W，工作 2s，间隔 3s，共 20min），离心后分离上清与沉淀，通过 SDS-PAGE 电泳分析蛋白表达情况。经灰度分析确定最优诱导条件为 0.5mM IPTG、28℃诱导 6h，此时可溶性蛋白占比达 70% 以上。

6. 蛋白表达产物鉴定

采用 Western blot 对表达产物进行验证，一抗为鼠抗 His 标签单克隆抗体（1:5000），二抗为 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（1:10000）。通过化学发光法显影，在约 25kDa 处观察到特异性条带，与预期 M 蛋白融合表达产物分子量一致，证实目的蛋白正确表达。

结果与分析

本研究成功克隆出 PEDV M 基因核心片段（630bp），重组质粒经双酶切及测序验证，目的片段正确插入载体且读码框无误。威尼德 Gene Pulser 630 指数衰减波电穿孔仪在转化效率上展现出显著优势，与传统 CaCl₂法相比，相同质粒浓度下阳性克隆数大幅提升，细胞存活率保持在较高水平，有效减少了电弧损伤对宿主细胞的影响。通过正交试验优化诱导条件，确定了最佳表达参数，可溶性蛋白产量达 1.2mg/mL，为后续抗原纯化及抗体制备提供了充足的材料保障。

讨论

在 PEDV M 基因原核表达体系中，威尼德 Gene Pulser 630 指数衰减波电穿孔仪的应用有效解决了传统转化方法存在的效率低、细胞损伤大等难题。其独有的智能波形调控技术，通过瞬时高强度电场重塑细胞膜通透性，实现了重组质粒的高效递送，尤其适用于 Rosetta (DE3) 等基因型复杂的表达宿主。仪器内置的预优化程序库包含常见菌种的一键式转化方案，避免了人工调试参数的繁琐过程，显著提升了实验重复性；智能阻抗检测功能可实时匹配细胞状态，确保每次电击条件精准可控，这对于维持宿主细胞活性及后续蛋白表达至关重要。此外，仪器的电弧防护电路设计杜绝了电火花干扰，保障了实验安全性与样本活性，脉冲中断时自动放电功能规避了数据偏差风险。

本研究构建的 M 基因表达体系不仅为 PEDV 诊断试剂盒开发奠定了坚实基础，更通过威尼德电穿孔仪的技术优势，彰显了先进设备在兽用生物制品研发中的关键作用。其模块化设计兼容微量体系，适用于病毒基因工程中珍贵样本的转化需求；600 组自定义协议存储与 100 条历史记录查询功能，便于实验室数据管理与跨团队共享，大幅提升了科研效率。随着全世界对动物疫病防控重视程度的不断提高，高效可靠的电转化技术在病毒抗原制备、亚单位疫苗研发等领域的重要性日益凸显。威尼德 Gene Pulser 630 指数衰减波电穿孔仪凭借其智能化、精准化的性能，为分子生物学实验提供了值得信赖的解决方案，助力科研人员在生命科学研究与产业化应用中抢占技术制高点。

参考文献

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