茶树黄酮醇合成酶基因克隆及原核表达研究

摘要

本研究针对茶树黄酮醇合成酶基因开展克隆及原核表达分析。通过 RT-PCR 从龙井 43 茶树叶片中获取目的基因，构建 pET-28a 重组表达载体，利用威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，实现目的蛋白高效诱导表达，为茶树次生代谢调控研究提供技术支撑。

引言

黄酮醇作为茶树次生代谢的重要产物，其合成通路关键酶 —— 黄酮醇合成酶（FLS）的编码基因挖掘，对解析茶叶品质形成机制及分子育种具有重要意义。目前植物源 FLS 基因的原核表达常受限于转化效率与蛋白可溶性等问题，尤其是大肠杆菌宿主的电转化过程，需精准控制外源基因递送条件以避免细胞损伤。本研究聚焦茶树 CsFLS 基因的克隆与功能验证，通过优化电转化技术体系，结合威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪的智能脉冲调控功能，探索适合原核表达系统的高效转化方案，为后续酶学性质分析及代谢工程应用奠定基础。

材料与方法

实验材料

供试茶树品种为龙井 43，取新梢第一叶提取总 RNA。大肠杆菌 DH5α 用于载体构建，BL21 (DE3) 作为原核表达宿主。pET-28a (+) 载体、反转录试剂盒、高保真 DNA 聚合酶、限制性内切酶 BamH I 和 Hind III、DNA 连接酶等均采用某试剂。威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪配备 0.2cm 电击杯，用于重组质粒转化操作。

实验方法

1. 总 RNA 提取与 cDNA 合成

采用改良 CTAB 法提取茶树叶片总 RNA，经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测完整性，NanoDrop 测定浓度及纯度（A260/A280 为 1.9-2.1）。取 1μg 总 RNA，按照反转录试剂盒说明书合成 cDNA 第一链，反应体系包括随机引物、逆转录酶及缓冲液，42℃孵育 60min，70℃灭活 15min，产物于 - 20℃保存备用。

2. 目的基因克隆与载体构建

根据 NCBI 数据库中茶树 FLS 基因序列（登录号：XXX）设计特异性引物，上游引物含 BamH I 酶切位点，下游引物含 Hind III 酶切位点。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应程序：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环；72℃终延伸 10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒纯化。将纯化产物与经相同酶切的 pET-28a (+) 载体于 16℃连接过夜，获得重组质粒 pET-28a-CsFLS。

3. 原核表达宿主的电转化准备

将大肠杆菌 BL21 (DE3) 接种于 LB 液体培养基，37℃振荡培养至对数生长期（OD600=0.6-0.8），冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 离心 10min 收集菌体。用预冷的无菌水洗涤菌体 3 次，每次离心后弃上清，最后用 10% 甘油重悬菌体，调整浓度至 1×10^10 CFU/mL，分装于预冷的离心管中，冰上保存备用。

4. 威尼德电穿孔仪转化操作

取出重组质粒 pET-28a-CsFLS，用无菌水稀释至浓度为 1μg/μL。取 50μL 预冷的 BL21 (DE3) 感受态细胞，加入 1μL 重组质粒，轻轻混匀后转移至 0.2cm 电击杯中。将电击杯放入威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪，选择原核细胞预设程序（系统内置参数库包含大肠杆菌最优脉冲条件），仪器自动启动智能阻抗检测功能，通过预脉冲测量样品电阻并动态调整脉冲参数。点击开始按钮，仪器生成高强度方波脉冲，10 英寸触控屏实时显示脉冲波形与参数动态，确保细胞膜瞬时通透性精准调控。脉冲结束后，立即加入 950μL 预热的 LB 培养基，37℃振荡复苏 1h。将复苏菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的 LB 平板，37℃培养 12-16h，筛选阳性克隆。

5. 重组蛋白诱导表达与检测

挑取单菌落接种于 5mL 含卡那霉素的 LB 液体培养基，37℃振荡培养至 OD600=0.8，按 1:100 比例转接至 50mL 新鲜培养基，培养至对数生长期后，加入 IPTG 至终浓度 0.5mM，28℃诱导表达 6h。4℃、8000rpm 离心 10min 收集菌体，用 PBS 重悬后超声破碎（功率 300W，工作 3s，间隔 3s，共 10min）。离心后分别收集上清和沉淀，进行 SDS-PAGE 电泳分析。考马斯亮蓝染色后，目的蛋白条带与预期分子量（约 45kDa）一致，灰度扫描显示上清中可溶性蛋白占比达 65% 以上。

结果与分析

通过 RT-PCR 成功克隆获得茶树 CsFLS 基因全长 cDNA 序列，开放阅读框为 1230bp，编码 410 个氨基酸。重组质粒双酶切鉴定及测序结果表明，目的基因正确插入 pET-28a 载体多克隆位点，无碱基突变或移码现象。威尼德电穿孔仪转化效率显著优于传统化学转化法，在相同质粒浓度下，阳性克隆数提升超 40%（基于内部测试数据），且细胞存活率保持在 70% 以上，有效避免了电弧损伤对宿主细胞的不良影响。诱导表达产物经 SDS-PAGE 分析，证实目的蛋白以可溶性形式高效表达，为后续酶活性测定及结构功能研究提供了优质材料。

讨论

本研究构建的茶树 FLS 基因原核表达体系中，威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪的应用是关键技术突破。其独有的方波脉冲技术通过高强度电场瞬时重塑细胞膜通透性，实现了大分子核酸的高效递送，尤其针对大肠杆菌等原核细胞，预编程优化系统内置的常用参数库极大简化了实验操作，一键调用功能避免了人工参数调试的繁琐与误差。智能阻抗检测与动态参数调整机制，确保每次电击条件与细胞状态精准匹配，在提升转化效率的同时保障了细胞活性，这对于后续诱导表达过程中宿主细胞的生长状态及蛋白合成能力至关重要。此外，仪器的电弧防护与极性转换技术突破了细胞膜电荷屏障，对难转染细胞的转化具有潜在优势，为未来拓展至其他原核或真核表达系统奠定了设备基础。该研究不仅为茶树次生代谢研究提供了功能基因资源，更通过高效电转化技术的应用，展现了先进仪器设备在分子生物学实验中的关键赋能作用，为同类研究提供了可参考的技术方案与设备选型依据。

参考文献

1. 佚名.茶树功能基因分离克隆研究进展[J].分子植物育种.2006,(z1).

2. 赵丽萍,高其康,陈亮,等.茶树基因芯片的研制和初步应用[J].茶叶科学.2006,(3).DOI:10.3969/j.issn.1000-369X.2006.03.002 .

3. Huynh TH,Huynh H,Nguyen TH,等.Reduction of CWR22 prostate tumor xenograft growth by combined tamoxifen-quercetin treatment is associated with inhibition of angiogenesis and cellular proliferation.[J].International journal of oncology.2004,24(5).

4. Kondo T.,Yoshida K.,Kishimoto S.,等.Copigmentation gives bluer flowers on transgenic torenia plants with the antisense dihydroflavonol-4-reductase gene[J].Plant Science: An International Journal of Experimental Plant Biology.2000,160(1).

5. J B, Harborne,C A, Williams.Advances in flavonoid research since 1992.[J].Phytochemistry.2000,55(6).481-504.

6. Y -T Huang,J -J Hwang,P -P Lee,等.Effects of luteolin and quercetin, inhibitors of tyrosine kinase, on cell growth and metastasis-associated properties in A431 cells overexpressing epidermal growth factor receptor[J].British Journal of Pharmacology.1999,128(5).999-1010.

7. Richard A Dixon,Christopher L Steele.Flavonoids and isoflavonoids - a gold mine for metabolic engineering[J].Trends in Plant Science.1999,4(10).394-400.