小麦抗病基因抑制消减杂交表达谱研究揭秘

一、引言

小麦作为中国最重要的粮食作物之一，其产量和品质受到各种病害的严重威胁。在长期的进化过程中，小麦自身发展出了复杂的抗病防御系统。然而，要全面解析小麦的抗病机制，需要深入了解在病原菌侵染过程中，小麦基因表达的动态变化。抑制消减杂交（SSH）技术为研究这种差异表达基因提供了一种强大的手段。通过构建在抗病和感病状态下小麦基因表达的消减文库，我们能够挖掘出那些在抗病反应中起关键作用的基因，这对于揭示小麦抗病的分子基础和培育抗病品种具有极其重要的意义。

二、材料与方法

（一）植物材料与病原菌处理

小麦品种选择

选用对特定病原菌具有不同抗性水平（抗病和感病）的小麦品种作为实验材料。这些品种在前期的田间试验和实验室接种鉴定中已明确其抗性特征。

病原菌接种与样本采集

将病原菌（如小麦条锈菌等）按照标准的接种方法接种到小麦幼苗上。对于条锈菌，采用孢子悬浮液喷雾接种，通过抖落于小麦叶片表面进行接种。接种后，在特定的环境条件（温度、湿度、光照等模拟自然发病环境）下培养。分别在接种后的不同时间点（如 6 小时、12 小时、24 小时、48 小时、72 小时等）采集小麦叶片组织，同时设置未接种的对照样本。采集的组织立即用液氮速冻，并保存于 - 80℃冰箱用于后续实验。

（二）RNA 提取与质量检测

总 RNA 提取

使用高质量的 RNA 提取试剂盒（如 TRIzol 试剂等）从采集的小麦叶片样本中提取总 RNA。提取过程中，严格按照试剂盒说明书操作，包括组织研磨、裂解、相分离、RNA 沉淀和洗涤等步骤，以确保获得高质量、无 DNA 污染的总 RNA。

RNA 质量检测

采用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性，观察 28S 和 18S rRNA 条带的清晰度和比例。同时，使用分光光度计检测 RNA 的浓度和纯度，要求 A260/A280 比值在 1.8 - 2.0 之间，以保证 RNA 的质量符合后续实验要求。

（三）抑制消减杂交（SSH）文库构建

双链 cDNA 合成

以提取的总 RNA 为模板，使用反转录酶合成第一链 cDNA。然后，在特定的反应体系中合成第二链 cDNA。在双链 cDNA 合成过程中，加入适量的引物和缓冲液，确保反应条件的准确性，如温度、时间等。

抑制消减杂交反应

将抗病和感病样本的双链 cDNA 分别作为 tester 和 driver。首先，对 tester cDNA 进行酶切处理，产生粘性末端。然后，将 tester 和 driver cDNA 进行两轮杂交。在杂交过程中，利用抑制消减杂交技术的原理，使差异表达基因在杂交过程中得到富集。具体而言，通过设计特定的引物和接头，使得只有在 tester 中特异表达或高表达的基因片段能够在后续的 PCR 扩增中得到有效扩增，而共同表达的基因则被抑制。

消减文库构建与克隆筛选

经过杂交和 PCR 扩增后，将获得的差异表达基因片段与合适的载体（如 pGEM - T Easy 载体等）连接，并转化到大肠杆菌感受态细胞中。通过蓝白斑筛选等方法，挑选出含有插入片段的阳性克隆，构建 SSH 文库。

（四）差异表达基因筛选与鉴定

菌落 PCR 鉴定

从构建的 SSH 文库中随机挑选菌落，进行 PCR 扩增。使用载体特异性引物，扩增插入的基因片段。通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的大小，初步判断插入片段的长度和多样性。

斑点杂交与 Northern 杂交

对菌落 PCR 鉴定有差异的克隆进行斑点杂交和 Northern 杂交进一步验证。在斑点杂交中，将 PCR 产物点样于尼龙膜上，与标记的探针（如从抗病和感病样本中提取的 cDNA 探针）进行杂交，检测基因的差异表达情况。Northern 杂交则是将总 RNA 进行电泳后转膜，再与标记的基因探针杂交，从 RNA 水平更准确地确定基因的表达差异。

序列测定与生物信息学分析

对经过验证的差异表达基因克隆进行序列测定。将获得的序列在公共数据库（如 NCBI 的 GenBank、Swiss - Prot 等）中进行同源性搜索和比对，确定基因的种类和可能的功能。同时，利用生物信息学工具分析基因的结构、启动子区域、保守结构域等信息，预测基因在小麦抗病过程中的作用机制。

三、结果

（一）RNA 提取质量

成功从接种病原菌和未接种的小麦叶片中提取了高质量的总 RNA，琼脂糖凝胶电泳显示 28S 和 18S rRNA 条带清晰，比例正常，分光光度计检测 A260/A280 比值符合要求，为后续实验提供了良好的起始材料。

（二）SSH 文库构建与分析

构建的 SSH 文库包含了大量的克隆，菌落 PCR 结果显示插入片段大小在一定范围内分布，表明文库具有较好的多样性。经过斑点杂交和 Northern 杂交验证，筛选出了一批在抗病和感病小麦样本中差异表达显著的基因。

（三）差异表达基因鉴定与功能分析

通过序列测定和生物信息学分析，鉴定出了多种类型的差异表达基因。其中包括与植物防御反应直接相关的基因，如病程相关蛋白基因（PR 基因），包括几丁质酶基因、β - 1,3 - 葡聚糖酶基因等，这些基因在抗病小麦中表达上调，可能参与了对病原菌细胞壁的降解。还有一些与信号转导相关的基因，如 MAPK 激酶基因、钙调蛋白基因等，它们在病原菌侵染后可能参与了细胞内的信号传递，启动抗病防御反应。此外，发现了部分转录因子基因，如 WRKY 转录因子、MYB 转录因子等，这些转录因子可能调控了一系列抗病相关基因的表达。

四、讨论

（一）SSH 技术在小麦抗病研究中的优势与局限性

抑制消减杂交技术在本研究中有效地富集了差异表达基因，使我们能够从复杂的小麦基因表达体系中筛选出与抗病相关的基因。然而，该技术也存在一定的局限性。例如，SSH 可能会遗漏一些低丰度但在抗病过程中具有重要作用的基因，而且对于一些基因家族成员可能无法准确区分。在后续研究中，可以结合其他基因表达分析技术，如 RNA - seq，进一步完善对小麦抗病基因表达谱的研究。

（二）差异表达基因在小麦抗病机制中的作用

所鉴定出的病程相关蛋白基因在植物防御反应中的作用已经有较多研究，它们通过降解病原菌细胞壁成分，抑制病原菌的生长和侵染。信号转导相关基因的变化表明小麦在感知病原菌侵染后，能够迅速启动细胞内的信号级联反应，激活防御相关基因的表达。转录因子基因的差异表达则提示了在小麦抗病过程中存在复杂的基因调控网络，这些转录因子可能通过结合到抗病相关基因的启动子区域，调控它们的转录水平。

（三）对小麦抗病育种的启示

本研究结果为小麦抗病育种提供了重要的基因资源和理论依据。可以利用现代分子育种技术，如基因编辑技术，对鉴定出的关键抗病基因进行编辑和改造，培育出具有更强抗病能力的小麦新品种。同时，通过对基因表达调控网络的深入理解，可以设计更合理的育种策略，提高育种效率。

五、结论

通过抑制消减杂交技术构建小麦抗病基因表达谱文库，我们成功筛选并鉴定出了一系列在小麦抗病过程中差异表达的基因。这些基因涉及防御反应、信号转导和基因调控等多个方面，为深入理解小麦抗病机制提供了重要线索。本研究结果对于小麦抗病育种和病害防治具有重要的指导意义，为保障小麦产量和品质奠定了分子生物学基础。同时，也为进一步研究植物 - 病原菌互作机制提供了有价值的参考。未来的研究可以在现有基础上，进一步深入探索这些基因的功能和相互作用，完善小麦抗病的分子机制模型。