Science Advances：单分子力谱揭示金黄色葡萄球菌对角质细胞粘附的分子机制

 单细胞力谱实验细节 

利用AB胶将直径6微米二氧化硅微球粘于无针尖的MLCT-O10悬臂A或者E上。后将固定好的探针置于含盐酸多巴胺（4mg/ml）的10mM Tris-HCl缓冲液（pH8.5）中孵育一小时，将多巴胺修饰于胶体探针上。利用多巴胺与细菌间静电力捕获单个细菌，将细菌修饰于探针上。然后利用修饰细菌的探针对角质细胞进行QI成像，ramp size 1μm，设定力500pN，速度30μm s^?1。扫描范围与像素可根据感兴趣区域进行设置，每个像素点均含有力-位移曲线信息。

 单分子力谱实验细节

DSG-1修饰探针制备

NPG-10探针浸入含1mM 10% 16-巯基十二烷酸/90% 1-巯基十一醇的乙醇溶液中过夜，用乙醇冲洗后，用N₂干燥。随后将探针浸入含N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；10mg/ml）和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（25mg/ml）的溶液中浸泡30分钟，用超纯水冲洗。最后，将它们与重组人DSG-1（0.1mg/ml）一起孵育1小时，用PBS缓冲液进一步冲洗，即获得DSG-1修饰探针。然后立即使用，无需脱湿。

p?PROX多肽修饰探针制备

用3-氨基丙基三乙氧基硅烷气相法反应对MLCT-BIO-DC悬臂梁进行氨基功能化修饰。氨基功能化后的悬臂梁浸入含1 mg NHS-PEG27-马来酰亚胺和30μl三乙胺的0.5 ml氯仿反应溶液中2小时。浸泡后，将悬臂梁用氯仿冲洗，并在氩气流下干燥。取100μl浓度为100μg/ml的p?PROX溶液，依次加入2μl EDTA（100mM，pH7.5）、5μl Hepes（1 M，pH7.5）、2μl三羟甲基氨基甲烷磷酸盐（TCEP）盐酸盐（100mM），最后加入2μl Hepes（1M，pH9.6）。将制备的混合液滴加至悬臂梁上，经2小时孵育后，用PBS彻底洗涤悬臂梁三次，即获得p?PROX多肽修饰探针。

将100倍稀释的过夜细菌悬液（50μl）置于聚苯乙烯培养皿中，静置15分钟后用PBS洗涤，随后向培养皿中注入PBS。单分子力谱设置为ramp size 1μm，设定力500pN，速度1 μm s^?1。

初始数据分析采用JPKSPM data processing软件完成，通过蠕虫状链模型（Worm-like chain WLC）对展开峰和粘附峰进行了拟合分析。

S. aureus通过细胞壁锚定表面蛋白附着于角质细胞。角质细胞通过角质桥连接，主要由desmoglein-1（桥粒蛋白-1，DSG-1）、corneodesmosin（角质桥蛋白，CDSN）和desmocollin-1（桥粒粘蛋白-1）构成，而DSG-1具有钙依赖性胞外区，其基因突变与皮炎、多重过敏及代谢性消耗症相关，凸显其在维持皮肤完整性及参与疾病发生中的关键作用。S. aureus表面蛋白serine-aspartate repeat protein D（SdrD）被鉴定为DSG-1的潜在配体，其结构如图1所示。SdrD的B重复序列形成刚性棒状结构，被认为具有缓冲功能，可将A结构域推离细胞表面，其正确折叠与结构完整性依赖Ca²⁺离子。 为验证SdrD是否促进细菌黏附于角质细胞，作者采用表面表达SdrD的乳酸乳杆菌（SdrD⁽⁺⁾）及缺乏该蛋白的对照菌株（SdrD^(?)）修饰的悬臂梁，对在含角质细胞的表面进行单细胞力谱（SCFS）测试，结果见图1。SdrD⁽⁺⁾探针比SdrD^(?)更大呈现更大的粘附力，表明相互作用由SdrD介导，而强相互作用集中在角质细胞边缘处，其表面覆盖着DSG-1蛋白。作者对多组数据进一步分析，结果见图2，SdrD⁽⁺⁾粘附力分布呈尖峰状，峰值位于2336±263pN，对应单个SdrD-配体复合物的断开, 而有些离散的粘附力峰4135±340pN，可能源于两条键的并行断开。

为确认DSG-1是SdrD的结合靶标，作者采用DSG-1修饰的探针进行单分子力谱（SMFS）实验。SMFS实验揭示在SdrD⁽⁺⁾乳酸乳杆菌上表现出强粘附力（2076±248pN），与上述SCFS结果相当，而在SdrD^(?)上未显示任何相互作用，这些结果证实DSG-1是SdrD的靶标。进一步对断开长度进行分析，在胶质细胞上断开长度在272±62nm，而单分子断开平均达431±104nm。该差异可归因于DSG-1的跨膜特性：SMFS检测的是全长蛋白（1049个氨基酸），而SCFS仅关注其EC区域（548个氨基酸）。断开长度分布表明pPROX可能是结合靶点。为了确认DSG-1的pPROX或pDIST区域是否为特异性结合位点，作者进行了大规模计算实验和p*PROX的肽段修饰的探针进行单分子力谱实验，与全长DSG-1构建体结果一致，p?PROX与SdrD的结合表现出nN级的机械稳定性，其粘附力1808±196pN，断开长度约为460±122nm，与全蛋白实验中观察到的长度非常接近。这些结果确认pPROX在DSG-1中包含正确的结合位点，并且与SdrD的单次相互作用具有高韧性，在纳牛级负荷下保持稳定。且91% SdrD⁽⁺⁾与角质细胞单细胞力谱呈锯齿状模式，在最终断开之前有多个（主要是2、3或4个）等间距的力峰（2213±267pN），平均峰间距为43±7nm，与完全展开的SdrD⁽⁺⁾B结构域预期长度相符，见图3。SdrD⁽⁺⁾:DSG-1以及 p?PROX: DSG-1单分子力谱也呈现同样的情况。

研究人员进一步研究了钙离子的影响，结果见图4。在去除钙（添加螯合剂1mM EDTA）时，力曲线展开基本被抑制（展开概率从91%降至5%）。添加10mM Ca²⁺后，锯齿形图案得以恢复，且高浓度Ca²⁺产生了更稳定的图案，显示出每个B域中Ca²⁺结合位点的作用。与此同时，Ca²⁺显著增强了A结构域的结合特性，断开力从2076±248pN增加到2601±163pN。这表明，Ca²⁺不仅调控SdrD B结构域的稳定性，还增强了A结构域的配体结合强度。

最后，与正常细胞相比，AD胶质细胞表面出现数百纳米的"圆形纳米物体"，对应于角质桥粒，且粘附行为不止发生在边缘，而是遍布整个细胞，印证了AD皮肤中DSG-1弥散分布的理论假设。单分子力谱(SMFS)实验也证实了SdrD是介导AD菌株与DSG-1结合的黏附蛋白。

The leading BioAFM for mechanobiology

?单分子、活细胞到组织样品的模量、硬度，粘弹性，以及黏附过程研究

?高级力谱功能，复杂单分子力谱实验的流程化快速设计。

?可编程化设计提供更高效率。

?单细胞力谱功能，可升级100 μm Z方向量程实现活细胞的原位力谱实验。

?可用于配体-受体相互作用力的测量，蛋白质解折叠动力学，膜蛋白相互作用等