Anal. Chem.：增强供体-受体光谱重叠促进荧光猝灭效率，用于开发灵敏的基于纳米金表面共振能量转移的免疫层析

《背景介绍》

  构建荧光猝灭免疫层析试纸条（FQ-ICTS）有利于实现靶标的灵敏检测，但较低的猝灭效率限制了FQ-ICTS的进一步发展。FQ-ICTS的性能依赖于受体对供体的高效猝灭，以实现超低荧光背景信号。因此，必须最大限度地提高受体的猝灭能力，以进一步提高FQ-ICTS的分析灵敏度。阐明FQ-ICTS的猝灭机理，探索影响猝灭效率的主要因素，有利于制备优良的受体猝灭剂。通常，FQ-ICTS的机理为内滤效应（IFE）或荧光共振能量转移（FRET）。IFE依赖于供体-受体光谱重叠，具有不受供体-受体距离限制的特点，但其信号输出可能受到非特异性干扰的缺点（如来自实际样品中非目标的散射光与供体的吸收/发射光谱重叠）。与IFE相比，FRET虽然可以通过抗原-抗体特异性结合避免其他物质的干扰，但其在距离限制<10nm。纳米金属表面共振能量转移（NSET）能够克服10nm的限制，并且在更长的距离（1至40nm）仍具有出色的猝灭效率。然而，基于独特NSET机制的FQ-ICTS的探索仍处于早期阶段。因此，构建一种新型的NSET-ICTS并探索影响其性能的关键因素对于实现靶标的高灵敏度检测具有重要意义。

  近期，河南农业大学食品安全与营养创新团队黄现青/宋莲军/张西亚教授报道了一种创新的NSET-ICTS，利用时间分辨荧光微球（TRFM）结合T2-BSA作为供体，以五种球形和花形金粒子（AuNPs-520，AuNPs-542，AuNPs-558，AuNPs-588，，AuNPs-605）标记的单克隆抗体（mAb）作为受体，通过调节AuNPs-mAb不同的吸收波长，探索供体-受体重叠面积对猝灭效率的影响规律，筛选出具有最高猝灭效率的NEST对，实现对T2毒素的高灵敏检测。相关成果以“Fortified Donor?Acceptor Spectral Overlap Facilitated Fluorescence Quenching Efficiency for Developing Sensitive Nanometal Surface Energy Transfer-Based Immunochromatographic Test Strips”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.4c06702）。

研究的主要内容

  该研究首先根据Stern?Volmer方程计算猝灭常数K_sv(λ)，供体荧光寿命变化及供体-受体之间的福克斯距离，验证了TRFMs-T-2-BSA与AuNPs-mAb之间的猝灭机制为NSET。随后研究了供体-受体重叠积分面积和猝灭效率以及NSET-ICTS的灵敏度之间的关系。结果发现，随着供体-受体的重叠积分面积的扩大，猝灭效率增加。随着AuNPs吸收波长的红移，供体与受体的重叠积分面积由7.75×10¹⁹增加到4.68×10²³ M^-1 cm^-1nm⁴，荧光猝灭效率由18.6%增加到92.7%。同时，相应的NSET-ICTS的IC₅₀值（0.62、0.42、0.22ng/mL）和qLOD（0.078、0.048、0.034ng/mL）均逐渐降低。在以TRFMs-610-T2-BSA为供体、以AuNPs-605-mAb为受体的配对中获得了最大的荧光猝灭效率92.7%，NSET-ICTS的检测限低至0.034 ng/mL，比传统的AuNPs-ICTS提高了13.2倍，具有良好的特异性和重复性。该传感器可以很好地应用于实际玉米样品的T2监测，回收率满足要求（95.5%至108.7%），与HPLC-MS/MS的结果有很好的相关性。

图一：

图1（A）供体和受体的制备，（B）供体-受体光谱重叠面积对猝灭效率影响示意图，（C）基于NSET-ICTS用于检测T2毒素的示意图（来源：Analytical Chemistry）

图二：

图2 （A）AuNPs-520、（B）AuNPs-542、（C）AuNPs-558、（D）AuNPs-588 和（E）AuNPs-605的TEM和粒径图。（F）最大吸收波长为520、542、558、588和605 nm的AuNPs的紫外可见光谱。（G）AuNPs和AuNPs-mAb的Zeta电位。（H）TRFMs的TEM图。（I）TRFMs与EDC/NHS的活化摩尔比。（J）TRFMs标记T2-BSA的优化。（K）TRFMs和TRFMs-T2-BSA的Zeta电位、（L）流体动力学尺寸和（M）荧光发射光谱。（来源：Analytical Chemistry）

图三：

图3 不同浓度的（A）AuNPs-605-BSA和（B）T2（0.03 nmol/LAuNPs-605-BSA）存在下TRFMs-T2-BSA的荧光光谱。不同浓度的（C）AuNPs-605-mAb和（D）T2（0.03 nmol/LAuNPs-605-mAb）存在下TRFMs-T2-BSA的荧光光谱。（E）TRFMs-T2-BSA-AuNPs-605-mAb和TRFMs-T2-BSA-AuNPs-605-BSA的Stern-Volmer图。（F）供体、供体分别与AuNPs-605-BSA和AuNPs-605-mAb反应时的荧光寿命。（来源：Analytical Chemistry）

图4 （A-E）受体的吸收光谱和供体的发射光谱。基于（F）AuNPs-520-mAb、（G）AuNPs-542-mAb、（H）AuNPs-558-mAb、（I）AuNPs-588-mAb和（J）AuNPs-605-mAb的ICTS在日光和紫外线下检测不同浓度T2的照片。编号1-7分别代表0、0.125、0.25、0.5、1、2和4 ng/mL的T2。（K）用于T2检测的NSET-ICTS示意图。（L）AuNPs-558-mAb、（M）AuNPs-588-mAb和（N）AuNPs-605-mAb的ICTS检测T2的标准曲线。（O）其它分析技术检测T2的灵敏度比较。（P）不同受体与TRFMs-T2-BSA结合的重叠积分面积与构建的NSET-ICTS的猝灭效率、qLOD的关系。（来源：Analytical Chemistry）

表1 AuNPs-mAb的ε₆₁₀、重叠面积、猝灭效率和NSET-ICTS的性能总结

图5 NSET-ICTS在可见光（A、C）和紫外线（B、D）下检测不同干扰毒素的特异性结果。编号1-9代表对照、DON、ZEN、FB1、OTA、NIV、T-2 四醇、HT-2 和T2。（来源：Analytical Chemistry）

图6 （A）NSET-ICTS检测不同稀释度基质中T2的标准曲线比较。（B）NSET-ICTS检测玉米中T2的回收率。（C）NSET-ICTS与HPLC-MS/MS 之间的T2相关性分析。（来源：Analytical Chemistry）

  综上所述，成功开发了一种基于TRFMs-T2-BSA-AuNPs-mAb的新型NSET-ICTS，用于玉米样品中T2的灵敏检测。系统地探索了NSET-ICTS的猝灭机理，并证明为NSET。通过调节受体的紫外吸收波长，研究了供体-受体重叠积分面积对猝灭效率的影响，表明增加重叠面积可实现高效猝灭效率，从而提高NSET-ICTS的灵敏度。得益于AuNPs-605和TRFMs的高猝灭效率(92.7%)，TANT-ICTS实现了检测T2的qLOD为0.034 ng/mL，比传统AuNPs-ICTS的检测限显著降低。此外，该方法还用于实际玉米样品种T2的检测，并与HPLC-MS/MS的结果良好相关，显示出较好的准确性。这项工作表明NEST机制在提高ICTS性能方面具有广阔的前景，并为实现猝灭型免疫层析的高效猝灭提供了一种创新思路。