生物传感器“探路”，大肠杆菌 L-苏氨酸产量提升

“Combining biosensor and metabolic network optimization strategies for enhanced l?threonine production in Escherichia coli”是 2025 年 3 月江南大学饶志明团队发表在 Biotechnology for Biofuels and Bioproducts 上的一篇文章。该研究提出了一系列工程策略，以进一步提高 L-苏氨酸生产菌的产能。

本研究不仅开发出一株具有工业应用潜力的 L-苏氨酸高产菌株，还展示了构建高灵敏度 L-苏氨酸生物传感器的新方法，为开发针对其他化学品的生物传感器提供了新的思路。

为开发高灵敏 L-苏氨酸生物传感器，研究者先对 MG1655 施加 0–60 g/L 外源苏氨酸并进行转录组学分析，筛得 32 个表达量与苏氨酸正相关的基因；进一步聚焦 21 个启动子构建 eGFP 报告文库后，确认 PcysK 响应最佳并呈线性，但天然元件阈值窄、假阳性高，需后续优化。

为克服天然传感器灵敏度低、阈值窄的缺陷，研究对“cys”系列启动子进行人工改造：

与现有系统相比，pSensorThr 误筛风险低但响应范围仍窄，需进一步优化响应范围以扩大适用性。

将温度敏感突变质粒 MP6ts 导入 THR36-L19，在 30 °C 诱变、42 °C 去质粒，快速构建大规模突变文库；随后引入 pSensorThr 并用 FACS、QPix 高通量筛选设备进行 5 轮“突变-筛选”循环，共挑出 50 株高产荧光突变株。摇瓶验证显示多数菌株产量优于出发菌，其中 THRM1 产量最高，达 38.97 g/L。

THRM1 高产源于“Tpx C61G”与“SpoT R290H→H290R 回复”两突变：产率提升≈3%。此外，敲除 tpx 或 spoT 分别微增或严重降产，证实二者作用。其余 4 个突变无显著贡献。转录组显示 THRM1 重调碳流：EMP 与乙醛酸途径上调、TCA 下调，pps 高表达补充 PEP；但 pykF、poxB、pflB 过表达造成碳流失。依次敲除这三基因，THRM6 产量升至 41.36 g/L。这些发现明确了关键遗传靶点，也为后续进一步提升产量提供了方向。

基于 iML1515 模型的 FBA 与 OptKnock 联合预测，锁定并验证两条增产途径：

氨基供应瓶颈——模拟显示 gdhA 通量需上调；构建 RBS 文库精细调控 GdhA 表达，THRM7 产量升至 44.12 g/L。

副产/外排基因敲除——将扩展后的 GSMN 与 OptKnock 结合预测 ydbK、ompN、aroL、phoA、puuE 5 个基因为敲除靶点，实验证实 ompN 敲除 和 phoA 敲除对菌株产量有效；组合后的 THRM13 摇瓶产量 46.02 g/L，5 L 罐补料分批发酵达 163.2 g/L,得率 0.603 g/g 葡萄糖，创大肠杆菌 L-苏氨酸报道的最高纪录。研究为后续天冬氨酸家族衍生物高产提供了系统化策略。

本研究开发了一种高灵敏度、高荧光阈值的生物传感器，并用于高通量平台筛选优异突变株。通过多组学分析指导的逆向代谢工程和计算机模拟，使工程菌株 THRM13 在 5 L 发酵罐中达到 163.2 g/L 的 L-苏氨酸产量，糖酸转化率为 60.3%，为迄今在不使用外源诱导剂和抗生素条件下报道的最高水平。此外，该高通量筛选策略仍可继续用于菌株的后续迭代进化。

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