酚接枝聚葡萄糖醛酸在生物墨水中的应用

本文开发了酚接枝聚葡萄糖醛酸（PGU-Ph），通过与酪胺共轭获得，其水溶液可在辣根过氧化物酶（HRP）催化下凝胶化。2.0 w/v% PGU-Ph 溶液（含 5 U/mL HRP）能成功打印出形状保真度高的水凝胶结构，包裹的小鼠成纤维细胞和人肝癌细胞打印后存活率约 95%，并存活 11 天。该研究证实 PGU-Ph 在组织工程，尤其是挤出式 3D 生物打印油墨中具有巨大潜力。 思维导图

详细总结

一、研究背景与目的

1. 聚葡萄糖醛酸（PGU）特性
   ：由 Sinorhizobium meliloti M5N1CS 菌株产生的高分子量葡萄糖醛酸均聚物，具有生物相容性、免疫刺激等多种生物活性，且微生物来源使其生产不受环境因素影响。
2. 研究目的
   ：合成酚接枝 PGU（PGU-Ph），通过 HRP 催化凝胶化制备生物墨水，应用于挤出式 3D 生物打印，评估其在组织工程中的潜力。

二、材料与方法

1. PGU 生产
   ：在 20 L 生物反应器中培养菌株，离心、超滤纯化后冻干获得 PGU。
2. PGU-Ph 合成
   ：在 MES 缓冲液中，通过 WSCD/NHS 活化，将酪胺共轭到 PGU 上，丙酮沉淀纯化，1H NMR 和 UV-Vis 表征。
3. 性能测试
• 流变学
  ：HAAKE MARS III 流变仪测量剪切速率 - 粘度曲线。
• 凝胶时间
  ：在 48 孔板中，HRP 和 H?O?触发凝胶化，磁搅拌受阻时为凝胶点。
• 机械性能
  ：EZ-test 测量压缩力，计算 Young's 模量。
4. 细胞实验
   ：CCK-8 法评估细胞存活率，荧光染色观察细胞形态。
5. 3D 打印
   ：改装 Bio X 系统，27 号针头挤出，H?O?气氛中凝胶化，评估形状保真度和细胞 viability。
   
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三、关键结果

1. PGU-Ph 合成表征
• 1H NMR
  ：PGU-Ph 在 6.7-7.2 ppm 出现酚羟基峰。
• UV-Vis
  ：275 nm 处出现酚羟基特征吸收峰，Ph 含量为 3.7×10?? mol-Ph/g PGU-Ph。
2. 溶液与凝胶特性
• 剪切稀化
  ：2 w/v% PGU-Ph 溶液在 1 s?1 时粘度约为 1 w/v% 的 8 倍，随剪切速率增加粘度显著下降。
• 凝胶时间
  ：2 w/v% PGU-Ph+5 U/mL HRP+1 mM H?O?时凝胶时间为 3.5 s，随 PGU-Ph 和 HRP 浓度增加而缩短，随 H?O?浓度增加先缩短后延长。
• 机械性能
  ：2 w/v% PGU-Ph hydrogel 的 Young's 模量为 2.0 kPa，随 HRP 和 H?O?浓度变化呈现先升后降趋势。
3. 细胞相容性
• 溶液实验
  ：0.5 w/v% PGU-Ph 对 10T1/2 细胞线粒体活性无显著影响，存活率与 PGU 相当，高于海藻酸盐（Alg）。
• 水凝胶实验
  ：PGU-Ph 单用水凝胶细胞粘附性低，与明胶 - Ph 混合后细胞粘附、增殖良好。
4. 3D 打印结果
• 形状保真度
  ：2 w/v% PGU-Ph 墨水在 H?O?气氛中可打印 2 mm 和 10 mm 高度的六边形结构，Young's 模量为 1.5±0.2 kPa。
• 细胞存活
  ：10T1/2 和 HepG2 细胞打印后存活率分别为 95% 和 94%，存活 11 天，HepG2 细胞形成聚集体。

四、讨论与结论

1. PGU-Ph 优势
   ：微生物来源易生产，HRP 催化凝胶化快速，细胞相容性好，适合 3D 生物打印。
2. 应用前景
   ：可用于组织工程构建、药物筛选，与明胶 - Ph 混合或引入细胞粘附配体可优化细胞行为。
3. 结论
   ：PGU-Ph 是挤出式 3D 生物打印的有前途材料，为功能性组织构建提供新选择。
   
   

关键数据表格

关键问题

1. 问题
   ：PGU-Ph 是如何合成的？
• 答案
  ：PGU-Ph 通过酪胺与 PGU 的共轭反应合成。具体步骤为：将 PGU 溶解在 MES 缓冲液（pH 6.0）中，依次加入酪胺盐酸盐、NHS 和 WSCD（浓度分别为 45 mM、10 mM、20 mM），室温搅拌 20 小时，然后用过量丙酮沉淀，90% 乙醇 + 10% 水洗涤至无游离酪胺，通过 1H NMR 和 UV-Vis 光谱确认合成成功。
2. 问题
   ：PGU-Ph 在 3D 生物打印中的凝胶化条件是什么？
• 答案
  ：PGU-Ph 在 HRP 催化和 H?O?存在下凝胶化。最佳条件为 2.0 w/v% PGU-Ph 溶液中加入 5 U/mL HRP，在含有 8 ppm H?O?的空气中挤出，凝胶时间可缩短至 3.5 秒，形成的水凝胶 Young's 模量为 1.5±0.2 kPa，具有良好的形状保真度。
3. 问题
   ：PGU-Ph 的细胞相容性如何证明？
• 答案
  ：通过细胞存活率和形态观察证明。10T1/2 细胞在 0.5 w/v% PGU-Ph 溶液中培养 24 小时后，线粒体活性与 PGU 组无显著差异（p=0.45），且高于 Alg 组（p<0.03）。打印后 1 天，包裹的 10T1/2 和 HepG2 细胞存活率分别为 95% 和 94%，并存活 11 天，HepG2 细胞在水凝胶中形成聚集体，证明 PGU-Ph 具有良好的细胞相容性。

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